利用基因工程生产限制性内切酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种生产限制性内切酶的方法，所述方法包括以下步骤：将与所述限制性内切酶相对的修饰酶基因克隆到载体的上游；在修饰酶的保护下，将限制性内切酶基因克隆至同一载体强启动子下游的多克隆位点中；转化表达宿主菌；筛选稳定、可诱导、高表达的限制性内切酶的菌株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种。
技术介绍
限制性内切酶是特异性识别DNA序列并在特定点将其切断的工具酶， 它们来源于不同的微生物，是细菌防御外来病毒入侵的武器。在20世纪60 年代中期，科学家推测细菌中有限制-修饰系统(restriction-modification system, R-M system)。该系统中有作用于同一 DNA序列的两种酶，即，消化 DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶，并且这 两种酶作用于同一DNA的相同部位。 一般说来，不同的细菌或不同的细菌菌 抹具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制-修饰系统。这些酶自七十年代后期在基因工程、分子生物学上被广泛应用，已有30 年历史。目前商品化的酶有230多种，常用酶有50多种。随着基因克隆技术 的应用，大大简化了限制性内切酶的生产过程，酶的纯度也更好。与一般基 因工程工具酶不同，限制性内切酶可将自身DNA切断而导致菌体不能存活。 所以要在大肠杆菌内工程化生产这种酶，必须先将这种酶的修饰酶基因导入 菌体并预先表达，或通过这种酶的限制-修饰调控序列来精确调控两种酶的表 达顺序。现有的克隆技术以及限制-修饰系统理论研究的限制使得工程菌抹很 难实现基因可诱导性表达。现有技术中生产限制性内切酶的方法主要是将限 制-修饰及调控基因以鸟枪法克隆入质粒，靠质粒的高拷贝数实现目的蛋白高 表达。这种生产方法的产量低、纯度差并且生产成本高，所以需要开发一种 产量高、纯度好并且生产成本低的生产限制性内切酶的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种生产限制性内切酶的方法，利用该方法生产酶的产量 高、酶的纯度好并且成本低。根据本专利技术的生产限制性内切酶的方法包括以下步骤将与所述限制性内切酶相对的修饰酶基因克隆到载体的上游；在修饰酶的保护下，将限制性 内切酶基因克隆至同 一载体强启动子下游的多克隆位点中；转化表达宿主菌； 筛选稳定、可诱导、高表达的限制性内切酶的菌抹。本专利技术上述方法中的修饰酶基因可选自曱基化酶基因，例如BHIM曱基 化酶基因。本专利技术方法中采用的载体可以是适合原核宿主的任何载体，优选地为 pEEB载体。本专利技术方法中釆用的宿主菌可以是任何原核宿主细胞。优选地为大肠杆菌。本专利技术的方法可以应用到生产以下限制性内切酶AatII、 Accl、 Acil、 Acll、 Afel、 AflII、 AflIII、 Agel、 Alul、 Alwl、 Apal、 ApaLI、 ApeKI、 Apol、 Ascl、 Asel、 AsiSI、 Aval、 Avail、 BamHI、 Banl、 BanII、 BbvCI、 Bbvl、 Bccl、 Bcll、 Bfal、 BfuCI、 Bgll、 BglII、 Blpl、 BmgBI、 Bmrl、 Bmtl、 BpulOI、 BsaBI、 BsaHI、 Bsal、 BsaJI、 BsaWI、 BseYI、 Bs正I、 BsiHKAI、 BsiWI、 BsmFI、 Bsml、 BsoBI、 Bspl2861、 BspDI、 BspEI、 BspHI、 BspMI、 BsrBI、 BsrDI、 BsrFI、 BsrGI、 Bsrl、 BssHII、 BssKI、 BssSI、 BstAPI、 BstBI、 BstEII、 BstNI、 BstUI、 BstXI、 BstYI、 BstZ171、 Bsu361、 Btgl、 BtgZI、 BtsCI、 Btsl、 AvrII、 Cac81、 Clal、 CspCI、 CviAII、 CviKI-l、 CviQI、 Ddel、 Dpnl、 DpnII、 Dral、 DraIII、 Drdl、 Eael、 Eagl、 Earl、 Ecil、 EcoNI、 EcoRI、 EcoRV、 Fatl、 Faul、 F皿4HI、 Fokl、 Fsel、 Fspl、 HaeII、 HaeIII、 Hgal、 Hhal、 HincII、 HindIII、 Hinfl、 HinPlI、 Hpal、 HpaII、 Hphl、 HpyAV、 Kasl、 Kpnl、 Mbol、 MboII、 Mfel、 Mlul、 Mlyl、 Mmel、 Mnll、 Mscl、 Msel、 Msll、 MspAlI、 Mspl、 Mwol、 Nael、 Narl、 Ncil、 Ncol、 Ndel、 NgoMIV、 Nhel、 N固、脂V、 NmeAIII、 Notl、 Nml、 Nsil、 Nspl、 Pacl、 PaeR71、 Pcil、 PflFI、 PflMI、 Phol、 Plel、 Pmel、 Pmll、 PpuMI、 PshAI、 Psil、 PspGI、 PspOMI、 PspXI、 Pstl、 Pvul、 PvuII、 Rsal、 RsrII、 Sacl、 SacII、 Sall、 Sapl、 Sau3AI、 Sau961、 Sbfl、 Scal、 ScrFI、 SexAI、 SfaNI、 Sfcl、 Sfil、 Sfol、 SgrAI、 Smal、 Smll、 SnaBI、 Spel、 Sphl、 Sspl、 Stul、 StyD41、 Styl、 Swal、 Taqal、 Tfil、 Tlil、 Tsel、 Tsp451、 Tsp5091、 TspMI、 TspRI、 Tthllll、 Xbal、 Xcml、 Xhol、 Xmal、 Xmnl、 Zral,优选地为限制性内切酶BamHI。根据本专利技术的示例性实施例，生产限制性内切酶的方法可以用于生产限 制性内切酶BamHI，采用的修饰酶是BHIM曱基化酶基因，采用的载体是pEEB载体。附图说明图1是根据本专利技术的生产限制性内切酶的方法的流程图； 图2是示出根据本专利技术实施例的BHIM曱基化酶基因的PCR扩增结果的 电泳测试图3是示出根据本专利技术实施例的BamHI限制酶基因的PCR扩增结果的 电泳测试图4是示出根据本专利技术实施例的克隆BHIM曱基化酶基因的结果的电泳 测试图5是示出采用限制性内切酶BglII和Sph I对克隆后的BHIM曱基化 酶基因进行酶切的结果的电泳测试图6是示出根据本专利技术实施例的将BHIM甲基化酶基因克隆到pEEB载 体上之后，挑取转化子作PCR扩增试验结果的电泳测试图7是示出根据本专利技术实施例的将BHIM曱基化酶基因克隆到pEEB载 体上之后，挑取转化子作Bgl II酶切试验结果的电泳测试图8是示出PCR鉴定BamHI插入片段的结果的电泳测试图9是采用Nde I和Sac I对pEEB-BHIM中的BamHI插入基因进行酶 切的结果的电泳测试图IO是采用SDS-PAGE检测根据本专利技术实施例制备的BamHI表达的测试图ll是用western-blot检测根据本专利技术实施例制备的BamHI表达的测试图。具体实施例方式本专利技术提供了 一种生产限制性内切酶的方法，根据本专利技术实施例的生产 限制性内切酶的方法包括以下步骤将修饰酶基因克隆到载体的上游；在修 饰酶的保护下，将内切酶基因克隆到同 一载体的强启动子下游的多克隆位点 中；转换表达宿主菌；筛选稳定、可诱导和高表达的限制酶的菌抹。在下文中，将以限制性内切酶BamHl和pEEB载体(由金普诺安蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产限制性内切酶的方法，所述方法包括以下步骤：　　　　将与所述限制性内切酶相对的修饰酶基因克隆到载体的上游；　　　　在修饰酶的保护下，将限制性内切酶基因克隆至同一载体强启动子下游的多克隆位点中；　　　　转化表达宿主菌；　　　　筛选稳定、可诱导、高表达的限制性内切酶的菌株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：安海谦，鲁刚伟，冉波，梅小伟，柳辉，
申请(专利权)人：金普诺安蛋白质工程技术北京有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]