木霉菌转化子的限制性内切酶介导基因整合化构建方法技术

本发明专利技术涉及一种木霉菌转化子的限制性内切酶介导基因整合化构建方法，首先通过产孢、菌丝培养以及采用崩溃酶酶液和山梨糖醇缓冲液处理，得到木霉菌菌株原生质体，然后将提取质粒ＤＮＡ与制备的木霉菌原生质体混合，在限制性内切酶的作用下，使外源线性质粒片段插入染色体组诱导插入突变，最后对突变的转化子进行筛选，得到比亲本生防效果更好的优良生物防治木霉菌突变株。本发明专利技术利用限制性内切酶介导的基因整合化技术可以得到大量的木霉菌转化子，并可从中筛选到对番茄灰霉病和黄瓜枯萎病等防治效果显著高于野生菌株的转化子，为扩大菌种资源，克隆生物防治基因资源，获得多功能生物防治菌株奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种木霉菌转化子的限制性内切酶介导基因整合化构建方法，其特征在于包括如下具体步骤：（１）木霉菌菌株原生质体的制备：首先将木霉菌在ＰＤＡ固体培养基上培养产孢后，用无菌水洗下木霉菌孢子，然后将木霉菌孢子加入ＰＤＢ液体培养基中，在２５－３ ０℃下，１００－１５０转／分摇床培养１８－２２小时，过滤收集菌丝，再用０．７摩尔／升ＮａＣｌ溶液冲洗菌丝；将崩溃酶用０．７摩尔／升ＮａＣｌ溶液配制浓度为１３－２０毫克／毫升的酶液，将上述得到的菌丝放入离心管，再将配制好的崩溃酶酶液以菌丝２倍体积的量加到离心管中，在２５－３０℃下以１２０－１５０转／分振荡培养３－４小时，然后过滤，并用０．７摩尔／升ＮａＣｌ溶液冲洗菌丝，收集原生质体于离心管中，将离心管得到的原生质体溶液离心、去上清；然后重复向离心管中加入山梨糖醇缓冲液冲洗原生质体沉淀、离心、去上清２－３次；再根据得到的原生质体的量向离心管中加入山梨糖醇缓冲液，调节原生质体浓度至１０↑［７］－１０↑［８］个／毫升；其中，所述山梨糖醇缓冲液的组分为：山梨醇３１６．２５６克、ＰＨ７．５的１摩尔／升Ｔｒｉｓ－Ｈｃｌ１０毫升、ＣａＣｌ↓［２］１．１１ｇ，加水定容到１０００ｍｌ；（２）质粒提取与ＤＮＡ消化：吸取含有质粒ＰＶ２的冷冻保存的菌种１００微升，加到含有５０微克／毫升的氨苄青霉素的１００毫升的ＬＢ液体培养基上，３７℃１４０－２００转／分摇床培养１ ２－１６小时，取已培养至对数生长期的１．５毫升细菌培养液放于１．５毫升的离心管中，５０００转／分离心５分钟，弃上清，向留有沉淀的离心管中加入１００微升含有５０毫摩尔／升葡萄糖，１０毫摩尔／升乙二胺四乙酸，２５毫摩尔／升ＴｒｉｓＨＣｌ的溶 液Ⅰ进行悬浮沉淀，冰浴５－１０分钟，再加入２００微升含２００毫摩尔／升ＮａＯＨ，１％ＳＤＳ的溶液Ⅱ，置冰浴５分钟使质粒ＤＮＡ变性后，再加入１５０微升含３摩尔／升醋酸钾，ｐＨ４．８的溶液Ⅲ，混匀，冰浴５－１０分钟；向离心管中加入４５０微升的按体积２５∶２４∶１配比的酚∶氯仿∶异戊醇的混合物进行抽提，１００００转／分离心１０分钟；吸取上清于另一离心管中，向其中加入与上清等体积的按体积２５∶２４∶１配比的酚∶氯仿∶异戊醇的混合物进行抽提，重复此抽提步骤２－３次；最后吸取上清于另一离心管中，向管中加入上清液的２倍体积的预冷无水乙醇，轻轻颠倒混匀，－２０℃放置３０分钟，１００００转／分离心１０分钟，倒掉上清，...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈捷，刘限，黄玉茜，管丽萍，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]