本发明专利技术提供了一种构建和生产重组Ⅲ型限制性内切酶Ｅｃｏｐ１５Ｉ的方法。Ⅲ型限制性内切酶Ｅｃｏｐ１５Ｉ在基因表达系列分析具有重要作用，而传统方法难以实现大规模的表达和纯化。本发明专利技术利用基因重组的方法，人工合成融合有纯化标签的Ｅｃｏｐ１５Ｉ的２个亚基片段，分别克隆到原核共表达载体ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１的两个独立表达单元中。在ＩＰＴＧ诱导下，具有独立的Ｔ７启动子、核糖体结合位点、起始密码子和终止密码子表达单元在大肠杆菌中，同时独立表达酶的２个亚基，并折叠成具有生物学活性的复合结构。再通过Ｎｉ亲和层析和ＤＥＡＥ离子交换层析的方法进行纯化。最终得到了产量较高，活力和稳定性较好的重组型Ｅｃｏｐ１５Ｉ内切酶，从而为大规模生产提供了有效的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组III型限制性Ecop151内切酶共表达质粒的构建、表达与纯 化，属于生物工程领域。通过本专利技术所提供的方法，获得了纯度较高、活力较 好的重组型Ecopl5I限制性内切酶，为大规模生产提供了有效的途径。同时，所 述的Ecopl51内切酶可以作为基因表达序列分析和相关基因识别的工具，具有很 好的应用价值。
技术介绍
"限制性内切酶" 一般认为是能识别双链DNA上4到8个核苷酸的特异性 序列，且能切割该序列的内切酶的总称。目前，已报道有2900余种限制一修饰 (R/M)系统被鉴别，根据其亚基组成、催化机制、酶切位置、识别序列、辅助 因子等因素，限制性内切酶可分为三大类。I型限制性内切酶是一类兼有限制性 和甲基化活性的多亚基蛋白复合体，可以在远离其识别位点处任意切割DNA链。 II型限制性内切酶是独立于对应甲基化酶的一种限制酶，其在识别位点之中或临 近的确定位点特异性地切开DNA链，产生确定的序列末端、限制片段，II型限 制性内切酶大部分都具有严格的底物特异性，识别4 6bp的回文序列。III型限 制性内切酶是兼有限制、修饰两种功能的酶，主要识别反向重复序列，在识别 位点之外不完全地切开DNA链。限制性内切酶Ecopl51是大肠杆菌P15质粒编码的III型限制性内切酶，是 由2个Mod亚基和2个Res亚基折叠形成407KDa大小的低聚复合酶。Mod亚 基通过限制与修饰的竞争作用来实现识别和修饰双重功能，其识别未甲基化的、 反向的、非回文结构的序列(5'-CAGCAG-3，)。Ecopl5I在识别位点下游上链(Top strand) 25 26nt位置和下链(Bottom strand) 27或28位置，在辅助因子Mg2+ 和ATP的作用下，酶切DNA序列。特别对DNA具有一对未甲基化的、反向的、 且具有一定空间距离的、对立位置的识别位点，酶切最为有效。其主要用途是 在基因表达分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE )中具有重要作用， 传统的SAGE仅能标签14个碱基序列，而在改进的"longSAGE "方案中也只有21个碱基序列的标签，而Ecopl51可以标签超过25个碱基序列，提高 了鉴定基因的效率和正确率。Ecopl51对基因的结构和表达的修饰发挥了很大的 作用，从而为各种医学、药物和农业应用提供了巨大的潜力。III型限制性内切酶Ecopl51在基因表达系列分析具有重要作用，但是目前 缺少实现大规模的表达和纯化的方法。目前生产这种酶的方式和一般限制性内 切酶并无不同，其步骤一般是1、 通过重组DNA技术，从微生物中获得目的基因并加以克隆。 常使用噬菌体感染用于识别和选择限制性酶的克隆，但此法成功率较低。这种方法是以包含转移限制一修饰系统为最初特征，由质粒装载到大肠杆菌克 隆载体上。此法通过克隆不断增加的限制一修饰系统，包含通过选择有甲基酶 基因活性地克隆，但这一选择系统并不总是得到完全的限制系统，而是只产生 出甲基化酶基因。在构建质粒库后，然后将其在适用宿主上转化，制备含内切 酶的粗提物，通过活性分析筛选出所需的克隆。2、 采用一些工艺技术对含有限制性内切酶基因的克隆进行过表达。 这些技术能够被单独或结合使用以获得限制性酶最大量的表达，主要有(1)、启动子通过大肠杆菌能够被很好的识别，直接插入到上游起始部分；(2)、 插入一个位于基因上游的核糖体结合位点；(3)、通过定向诱变或使用密码子自 身合成基因从而改变基因的DNA序列；(4)、使用多聚酶链式反应(PCR)和 合成基因5'端和3'端的杂交引物而放大表达。3、 在合适的培养基中，用发酵器增值携带该内切酶修饰性和限制性的克隆， 以生产该限制性核酸内切酶，然后经离心收获细胞并经超声振荡破坏之，制得 含限制性内切酶活性的细胞粗提物；4、 用标准的蛋白质纯化技术如亲和层析或离子交换层析法纯化含限制性内 切酶活性的细胞粗提物。采用上述传统方法，对于大规模生产III型限制性内切酶EcoP15I存在以下问题1. Ec叩15I限制性内切酶是野生型大肠杆菌P15质粒编码的，在没有EcoP151 基因克隆来源或来源较困难的情况下，需要人工合成来获得目的基因。2. Ecopl5I是一个407KDa大小的低聚复合酶，具有Mod和Res2段基因。在E.coli pl5质粒中，具有Mod和Res两个开放阅读框(ORF)，具有活性的限制性 内切酶实质上是Mod2Res2这样一个四聚体。而采用上述技术无法有效表达III型 限制酶Ecopl5I这样一种结构的酶，因此需要新方法改进表达系统。3.采用传统方法对EcoP15I进行纯化，产物一般是DNA转甲基酶(Mod2)和限 制性内切核酸酶(Mod2Res2)的混合物。纯化lmg酶， 一般需要7-8升细菌培养液， 并且整个纯化过程需要10-14天，由此得到的产量是0.1mg/g细胞。另一个问题 是，有限的保存稳定性，尤其是工艺上冰冻的EcoP15I融化后是无活性的。较之上述传统方法，本专利技术具有以下特色本专利技术首先利用重叠PCR的方法，人工合成长片段基因，获得目的基因。 该方法能用于一些来源困难的基因，或来源危险(诸如病毒基因)的基因的人 工合成。Ecopl5I限制性内切酶是大肠杆菌P15质粒编码的，在没有基因克隆来 源或来源较困难的情况下，采用了人工合成的方法，获得目的基因。并且分析 了Ec叩15I基因编码的密码子频率，与大肠杆菌BL21(DE3)密码子频率比较，稀 有密码子出现的频率比较低。其次，本专利技术最主要的特色是选择了大肠杆菌共表达的方式，以表达 Ecopl51酶这样具有2个及2个以上单体的蛋白复合体。III型限制性酶Ecopl51 是一个407KDa大小的复合酶，具有2个Mod亚基和2个Res亚基。若单纯融 合2段基因，表达较高分子量的融合蛋白，表达效果不好，且可能由于2段蛋 白单体的融合，引起了折叠结构的改变，影响了蛋白复合体的生物学活性。而 本专利技术利用共表达的方法可以解决这一问题，并且操作简便易行。纯化效率较高，纯化lmg酶仅仅需36ml细菌培养液，整个纯化时间需要5-7 天，EcoP15I产量约为5.6-6.6mg/g细胞，产量较高。此夕卜，本专利技术生产的EcoP151, 放置于4。C和-20T长时间活力保持不变，稳定性较高。
技术实现思路
本专利技术提供了一种有效的方法和表达系统，可用于大规模生产m型限制性内切酶Ecopl51。本专利技术利用生物工程的方法，根据Genebank中的Ecopl5I基因序 列，设计数十对引物，利用重叠延伸PCR的方法(OverlappingPCR)，人工合成 获得了目标序列(见附图l)。合成好的两段基因再分别亚克隆到具有两个独立6T7启动子、核糖体结合位点的共表达载体pACYCDuet-l中，在Res亚基C端和Mod 亚基N端分别各融合了6XHisTag。通过镍亲和层析、离子交换层析方法，制备 了纯度高达95%以上、活力与商业化Ecopl5I相似的重组型限制性内切酶。本法明的主要特色就是构建III型内切酶Ecopl51共表达质粒。目前共表达 的实现途径主要有双/多载体共转化法，双/多顺反子法和双/多启动子载体法等。 对于双/多载体共转本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种构建Ⅲ型限制性内切酶ＥｃｏＰ１５Ⅰ共表达质粒（ｐＡＣＹＣ＿Ｐ１５）的方法，步骤包括： （１）人工合成包含Ｒｅｓ亚基和Ｍｏｄ亚基的３段基因，分别为Ｅｃｏ＿Ｍｏｄ、Ｅｃｏ＿ＲｅｓⅠ和Ｅｃｏ＿ＲｅｓⅡ，３段基因分别通过平端克隆，装载到ｐ ＵＣ５７中，获得ｐＭｏｄ，ｐＲｅｓ＿Ⅰ和ｐＲｅｓ＿Ⅱ三个质粒；将ｐＲｅｓ＿Ⅰ和ｐＲｅｓ＿Ⅱ用ＢｇｌⅡ和ＮｏｔⅠ双酶切后，Ｔ４连接酶酶连，获得完整的Ｒｅｓ片段的ｐＲｅｓ＿Ａｌｌ质粒； （２）将ｐＭｏｄ质粒与ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１质粒Ｂａ ｍＨⅠ和ＳａｌⅠ双酶切后酶连，获得包含Ｍｏｄ亚基的ｐＡＣＹＣ＿Ｍｏｄ质粒，再与ｐＲｅｓ＿Ａｌｌ质粒ＫｐｎⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切后酶连，获得包含完整的Ｅｃｏｐ１５Ⅰ两个亚基ｐＡＣＹＣ＿Ｐ１５质粒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陆毅祥，陈莉，黄兵，孙云成，戴雪，朱远源，
申请(专利权)人：百奥生物技术南通有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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