本发明专利技术公开了一种制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的DNA片段的方法。本发明专利技术中，根据骨架载体上预期插入的多克隆位点设计两对引物，以含有目的基因的DNA为模板，分别用两对引物进行PCR扩增，得到两种PCR扩增产物，将两种PCR扩增产物混合后依次进行变性和退火，得到目的DNA片段(两端带有相应限制性内切酶的粘性末端，中间为目的基因)，目的DNA片段可以定向克隆至骨架载体的预期多克隆位点。与传统PCR产物克隆方法相比，本发明专利技术所提供的克隆方法简单易行，成本低，效率高，通用性好，可以广泛应用于PCR产物的快速定向克隆。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种制备两端带有限制性内切酶粘性末端的目的DNA片段的方法。
技术介绍
自PCR技术问世以来，适应PCR产物测序、改造和表达等需要，先后出现了多种克隆方法，包括在引物中引入完整酶切位点克隆法、无需连接反应的克隆方法、T 载体克隆法> 平 TfC ^ 、Hetero-stagger 克隆技术 > autosticky PCR ^ * 、无酶克隆法、嵌合引物克隆法、3GC 克隆技术等。这些方法各具特色，但也均存在各种局限性。以第一种克隆方法为例，该方法最早被用于PCR产物的克隆，目前仍然是最流行的一种克隆技术。该方法存在两个明显缺陷首先，多种II型限制性DNA内切酶对位于DNA 末端的识别位点切割效率很低，需要在引物的5’端添加较长的保护碱基才能有效切割PCR 产物，但添加过长的保护碱基可能会影响PCR扩增效果；其次，插入片段内含的限制酶位点会影响克隆位点的选择，一些较长的PCR产物可能会含有较多种限制酶位点，不能方便地连接到载体中，实验人员为克隆不同的PCR产物往往需要准备多种不同的内切酶，增加了克隆的难度和费用。使用较广的另一种克隆方法-T载体克隆法，同样存在两大不足其一，此方法只能用于保真度最低的DNA聚合酶-Taq酶扩增产物的克隆，高保真DNA聚合酶(如PfiuVent酶等)扩增产物的末端为平末端，不能直接克隆到T载体中；其二，目前商用的各种T载体一般只能作为克隆载体，而不能作为表达载体，对于需要表达的基因，必须进行二次克隆， 费时费力，而且在二次克隆时，同样需要考虑表达载体上是否有合适的克隆位点。后来专利技术的其它各种克隆方法，虽然能够不同程度地解决以上两种方法固有的问题，但自身或多或少存在效率低、成本高、周期长、技术复杂等不同的缺点，没有一种能够像前两种方法那样得到广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备可用于定向克隆的两端带有限制性内切酶粘性末端的目的DNA片段的方法。本专利技术提供的制备两端带有限制性内切酶粘性末端的双链DNA片段的方法(孪生 PCR)，包括如下步骤(1)制备引物对甲和引物对乙；所述引物对甲由上游引物甲和下游引物甲组成； 所述引物对乙由上游引物乙和下游引物乙组成；所述引物对甲和所述引物对乙用于扩增同一目的DNA片段；所述上游引物甲的5'末端具有限制性内切酶甲识别序列中切割位点下游的全部序列；所述下游引物甲的5'末端具有限制性内切酶乙识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述上游引物乙的5'末端具有所述限制性内切酶甲识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述下游引物乙的5'末端具有所述限制性内切酶乙识别序列中切割位点下游的全部序列；(2)用所述引物对甲PCR扩增所述目的DNA片段，得到PCR扩增产物甲；用所述引物对乙PCR扩增所述目的DNA片段，得到PCR扩增产物乙；( 将所述PCR扩增产物甲和所述PCR扩增产物乙混合后依次进行变性和退火，得到5'末端带有限制性内切酶甲识别序列的粘性末端且3'末端带有限制性内切酶乙识别序列的粘性末端的双链DNA片段。步骤(3)中，所述PCR扩增产物甲和所述PCR扩增产物乙最好等摩尔混合。所述限制性内切酶甲的切割位点可位于所述限制性内切酶甲的识别序列内；所述限制性内切酶乙的切割位点可位于所述限制性内切酶乙的识别序列内。步骤⑴中，所述限制性内切酶识别序列均指的是5' -3'单链。步骤⑶中， 所述限制性内切酶识别序列均指的是双链。以上任一所述方法均可用于构建重组载体。本专利技术还保护一种制备重组载体的方法，包括如下步骤(1)用所述限制性内切酶甲和所述限制性内切酶乙酶切出发质粒，回收载体骨架；所述出发质粒中含有所述限制性内切酶甲的识别序列和所述限制性内切酶乙的识别序列；(2)将用以上任一所述方法制备的5'末端带有限制性内切酶甲识别序列的粘性末端且3'末端带有限制性内切酶乙识别序列的粘性末端的双链DNA片段与步骤(1)得到的载体骨架连接，得到重组载体。本专利技术还保护引物对甲和引物对乙组成的引物组合物；所述引物对甲和所述引物对乙用于扩增同一目的DNA片段；所述上游引物甲的5'末端具有限制性内切酶甲识别序列中切割位点下游的全部序列；所述下游引物甲的5'末端具有限制性内切酶乙识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述上游引物乙的5'末端具有所述限制性内切酶甲识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述下游引物乙的5'末端具有所述限制性内切酶乙识别序列中切割位点下游的全部序列。本专利技术中，根据骨架载体上预期插入的多克隆位点设计两对引物，以含有目的基因的DNA为模板，分别用两对引物进行PCR扩增，得到两种PCR扩增产物，将两种PCR扩增产物混合后依次进行变性和退火，得到目的DNA片段(两端带有相应限制性内切酶的粘性末端，中间为目的基因)，目的DNA片段可以定向克隆至骨架载体的预期多克隆位点。与传统PCR产物克隆方法相比，本专利技术所提供的克隆方法(孪生PCR克隆法)不需使用限制酶处理PCR产物，即可得到含有任意限制酶粘性末端的DNA片段，出发载体的多克隆位点全部可以使用，无需考虑目的基因中是否含有与载体多克隆位点相同的酶切位点，因而可轻松实现目的基因的定向克隆。本专利技术所提供的克隆方法简单易行，成本低，效率高，通用性好， 可以广泛应用于PCR产物的快速定向克隆。附图说明图1为琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。泳道1 :DNA分子量标准；泳道2 =PCR扩增产物甲；泳道3 :PCR扩增产物乙。图2为用PCR扩增产物甲和PCR扩增产物乙得到混合DNA片段(DNA片段I、DNA 片段II、DNA片段III和DNA片段IV)的示意图。图3为质粒pFLAG-CMV2多克隆位点示意图。图4为10个阳性克隆中质粒的酶切鉴定。图5为重组质粒pFLAG-CMV2-PCGFl的部分测序结果。A中的EcoR I为上游克隆位点，B中的EcoR I为PCGFl内含的EcoR I位点。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中使用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定 DNA片段的浓度。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。所有引物合成及测序工作均由英潍捷基(上海)贸易有限公司北京办事处完成。Deep Vent DNA聚合酶、限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自New England Biolabs 公司。Taq DNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司。人白细胞cDNA文库购自美国 Clontech公司，产品目录号为638821。质粒pFLAG_CMV2为Sigma公司产品，产品目录号为 E7398(其多克隆位点示意图见图3)。大肠杆菌DH5ci为天根生化科技(北京)有限公司产品，产品目录号为CB101-03。实施例中用于培养大肠杆菌的培养基均为LB培养。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、应用孪生PCR定向克隆一、引物设计根据多梳环指l(polycomb group ring finger 1，PCGF1)基因(PCGF1 基因)的 mRNA序列(GenBan本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种制备两端带有限制性内切酶粘性末端的双链ＤＮＡ片段的方法，包括如下步骤：（１）制备引物对甲和引物对乙；所述引物对甲由上游引物甲和下游引物甲组成；所述引物对乙由上游引物乙和下游引物乙组成；所述引物对甲和所述引物对乙用于扩增同一目的ＤＮＡ片段；所述上游引物甲的５′末端具有限制性内切酶甲识别序列中切割位点下游的全部序列；所述下游引物甲的５′末端具有限制性内切酶乙识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述上游引物乙的５′末端具有所述限制性内切酶甲识别序列中切割位点上游的全部序列的反向互补序列；所述下游引物乙的５′末端具有所述限制性内切酶乙识别序列中切割位点下游的全部序列；（２）用所述引物对甲ＰＣＲ扩增所述目的ＤＮＡ片段，得到ＰＣＲ扩增产物甲；用所述引物对乙ＰＣＲ扩增所述目的ＤＮＡ片段，得到ＰＣＲ扩增产物乙；（３）将所述ＰＣＲ扩增产物甲和所述ＰＣＲ扩增产物乙混合后依次进行变性和退火，得到５′末端带有限制性内切酶甲识别序列的粘性末端且３′末端带有限制性内切酶乙识别序列的粘性末端的双链ＤＮＡ片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢云飞，解博红，徐光翠，李小英，闫清华，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：41
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