一种检测单碱基突变的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种检测单碱基突变的方法及应用，包括针对待测样本与参照的目标区段设计引物，PCR分别扩增；将扩增产物等量混合，高温变性再退火获得异质双链DNA，再经CEL I酶切，酶切产物电泳检测确定单碱基突变样本；回收其中被CEL I酶切开的两个片段，每个片段分别与带A、T、G或C粘性末端的接头连接；用于扩增目标片段的上下游引物中的一条和基于接头序列设计的正反向引物中的一条组成两对引物，分别以每个连接产物为模板，进行PCR扩增；电泳检测。本发明专利技术公开的检测单碱基突变的方法，既可以检测已知的单碱基突变，也可以筛查未知的单碱基突变，既可以确定突变的位置，又可以确定突变的类型，灵敏度高、重复性好又经济。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种检测单碱基突变的方法及应用。
技术介绍
单核苷酸变异(点突变)是指在DNA特定位置发生一个核苷酸的改变，广泛存在于生物体遗传信息的编码中，当较少出现的等位基因频率大于或等于1％时，则称为单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)。对点突变的研究有助于深入认识高等生物的遗传特性，解释个体的表型差异，揭示基因、信息、蛋白质的正常功能，变异的成因以及不同个体对环境变化的响应机制，对功能基因组学研究和建立分子标记都具有重要意义。随着基因组测序工作的开展，点突变的检测和筛选正成为人们关注的焦点，检测方法也随之迅速发展；此外，当点突变所造成的基因理化特性改变比较微弱时，则使得点突变的检测非常困难，这也使得人们从多方面探索和建立新的检测方法。PCR-RFLP是最早用于分析已知点突变的方法。如果点突变正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用PCR特异扩增的这段DNA经某一限制酶消化后，再通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，即可确定是否存在点突变。这种检测具有较高的特异性，重复性好，但仅适于涉及到特定限制性内切酶识别位点的突变检测和突变频率大于1％的多态性检测，不能提供究竟是何种碱基的突变。依赖于DNA变性动力学的PCR技术和高分辨熔解曲线分析技术(high-resolutionmeltinganalysis，HRM)也能用于SNP的检测。扩增片段内若存在点突变，则通过Tm值的差异或变性过程中双链DNA饱和染料释放荧光信号强度的差异，可将存在错配碱基的双链DNA与纯合的双链DNA相区分开来。它们可以用于SNP的快速检测，但只适合于对小片段的分析，且不能确定具体的突变碱基与部位。单链DNA由于碱基序列的不同可以引起其构象差异，这种差异将造成相同或者相近长度的单链DNA电泳迁移率的差别，即单链构象多态性(signlestrandconformationpolymorphism，SSCP)。因此，目标基因通过PCR扩增、变性及电泳后，突变所引起的DNA构象差异则表现为电泳条带位置的差异而用于SNP的分析中。但是，单个碱基突变的检出率会随着DNA片段的长度的增加而降低，同时，SSCP不能够确定所分析DNA片段中突变的类型及位置并且耗时长。当DNA在一定梯度变性剂浓度的凝胶中电泳，即变性梯度凝胶中电泳(denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE)时，具有碱基差异的DNA片段会在不同的地方开始解链，从而达到分离的目的。虽然DGGE检测的片段长度可以达到1kb，但是它耗时较长、使用条件较难优化并且不能确定所分析DNA片段中突变的类型和位置。变性高效液相色谱(denaturinghighperformanceliquidchromatography，DHPLC)是一项在SSCP和DGGE基础上发展起来的一种检测SNP的突变技术。带正电荷的流动相可以吸附带负电的DNA分子，同时，因为同源双链与异源双链具有不同的退火温度，因此通过控制DHPLC的温度，使系统维持在异源双链解链时的温度时，即可以将其分离，SNP的有无最终表现在色谱峰的峰形和数目上。虽然DHPLC在寻找未知的SNP上有明显的优势，但是对已知SNP不可能实现100％的检出，同时对每个DNA片段的分析则都需要优化相应的运行温度，不能确定突变的碱基。使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)技术也可以用于检测SNP，但是它需要将目的片段转化为DNA/RNA镶嵌结构，并且在分析之前还需要用四种核酸酶进行预处理，同时在费用上也不具有竞争优势。基因芯片技术将大量探针分子固定在支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，可用于大规模检测基因突变、基因多态、基因表达水平以及测定DNA序列，具有检测信息高通量和自动化程度高等特点，但费用较高，且容易漏检SNP。相对而言，酶学突变检测是一种较为简便、有效的点突变检测技术，它的建立依赖于特异性核酸酶的发现和利用，如S1核酸酶、核糖核酸酶、T4内切核酸酶、MutY、绿豆核酸酶、芹菜核酸酶CELI等都已用于点突变的检测，能够确定突变的位置，但也不能确定具体突变的碱基。通过DNA测序技术可直接获取目的片段的碱基序列，通过序列间的比较，可以直观而有效的寻找SNP，是一种最为有效而且可靠的SNP检测方法，且可确定SNP的位置及突变的碱基。虽然随着测序的自动化程度的提高及测序成本的降低，直接测序越来越多的应用于SNP检测中，但需要重复测序和确认才能将杂合体从序列误差中区别出来，而且测序的费用仍然很高、费时。由上所述可见，随着新技术、新材料和设备的不断涌现，点突变检测技术得到了迅速的发展，但大多数不能确定具体的突变碱基，而能够确定突变碱基的方法(如测序法)则需要专门的分析仪器，不仅价格昂贵，而且操作复杂、专业性强，在应用上受到了一定的限制。因此，开发简便和快速确定具体的突变碱基的新检测方法十分必要。
技术实现思路
本专利技术提供了一种检测单碱基突变的方法及应用，该方法不但可以检测是否存在单碱基突变及突变所在的位置，而且无需测序即可快速确定是哪种突变碱基。一种检测单碱基突变的方法，包括以下步骤：(1)针对待测样本与参照的目标区段设计引物对，PCR分别扩增；(2)将两组扩增产物形成的异质双链产物用CELI酶切，酶切产物经电泳检测确定单碱基突变；(3)回收CELI酶所切开的两个片段，每个片段分别与带有A、T、G或C粘性末端的4种人工接头连接；(4)把基于人工接头序列设计的反向引物与扩增目标基因或DNA片段的上游引物以及基于人工接头序列设计的正向引物与扩增目标基因或DNA片段的下游引物组成两对引物，分别以每个连接产物为模板进行PCR扩增；(5)对有所PCR产物进行电泳检测，所得结果与单碱基错配类型的对应关系如下：错配碱基接头A接头T接头G接头CA-A√C-C√G-G√T-T√A-C√√G-A√√C-T√√T-G√√其中“√”表示有扩增。步骤(2)中确定单碱基突变样本的方法为：CELI酶切产物的电泳结果，如果只有一条目的基因条带，说明待测样本中不存在单碱基突变；除目的基因条带外还本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测单碱基突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据需要检测的目标基因或DNA片段的序列设计引物，对待测样本和参照分别进行PCR扩增；(2)将两组扩增产物形成的异质双链产物用CEL I酶切，酶切产物经电泳检测确定单碱基突变；(3)回收CEL I酶所切开的两个片段，每个片段分别与带有A、T、G或C粘性末端的4种人工接头连接；(4)把基于人工接头序列设计的反向引物与扩增目标基因或DNA片段的上游引物以及基于人工接头序列设计的正向引物与扩增目标基因或DNA片段的下游引物组成两对引物，分别以每个连接产物为模板进行PCR扩增；(5)对所有PCR产物进行电泳检测，所得结果与单碱基错配类型的对应关系如下：其中“√”表示有扩增。

【技术特征摘要】
1.一种检测单碱基突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据需要检测的目标基因或DNA片段的序列设计引物，对待测样本和参照分别进
行PCR扩增；
(2)将两组扩增产物形成的异质双链产物用CELI酶切，酶切产物经电泳检测确定单碱
基突变；
(3)回收CELI酶所切开的两个片段，每个片段分别与带有A、T、G或C粘性末端的
4种人工接头连接；
(4)把基于人工接头序列设计的反向引物与扩增目标基因或DNA片段的上游引物以及
基于人工接头序列设计的正向引物与扩增目标基因或DNA片段的下游引物组成两对引物，
分别以每个连接产物为模板进行PCR扩增；
(5)对所有PCR产物进行电泳检测，所得结果与单碱基错配类型的对应关系如下：
其中“√”表示有扩增。
2.如权利要求1所述的检测单碱基突变的方法，其特征在于，步骤(2)中确定单碱基
突变样本的方法为：CELI酶切产物的电泳结果，如果只有一条目的基因条带，说明待测样
本中不存在单碱基突变；除目的基因条带外还有2条新条带，并且两者的长度之和与目的基
因大小一致，说明存在单碱基突变。
3.如权利要求1所述的检测单碱基突变的方法，其特征在于，所述异质双链产物的制备
方法为：将等质量的参照扩增产物和待测样本扩增产物混合，再进行高温变性和降温复性。
4.如权利要求1所述的检测单碱基突变的方法，其特征在于，所述异质双链产物的制备
方法为：在PCR扩增时用参照与待测样...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔海瑞，吴穹宇，袁兵，宋悦，朱斌，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33