本发明专利技术公开了线粒体突变性耳聋的多重Taqman荧光检测试剂盒，该试剂盒含有SEQ ID NO:1～2所示的引物，SEQ ID NO:3～6所示的探针，还含有DNA聚合酶、阴性对照品等。目前来说耳聋的临床诊断主要是博奥公司生产晶芯九项耳聋基因检测芯片，每个位点检测费用为100元。芯片储存条件要求严格，设备高端，检测步骤繁琐耗时长。而本发明专利技术是一种简便有效，花费低，准确度高的方法；无需高端设备，所有试剂存放于4摄氏度冰箱即可。单孔同时检测两个位点，只需一步PCR就可以得出结果，两个位点检测费用成本40元左右。可见本发明专利技术试剂盒及检测方法使得检测快速，准确，花费低，有利于耳聋筛查的普及。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及线粒体突变性耳聋的多重Taqman荧光检测试剂盒。
技术介绍
耳聋又称感音神经型耳聋，是一种严重影响个人生活质量和社会人口素质的听力缺陷病。根据病因，耳聋可以分为遗传性耳聋和非遗传性耳聋。其中遗传性耳聋占50%。遗传性耳聋根据遗传方式又分为常染色体遗传，性染色体遗传，线粒体遗传。其中线粒体遗传又称母系遗传，女性携带者将突变遗传给其下一代的概率是100%。线粒体遗传性耳聋还有个特别临床表现“一针致聋”。线粒体遗传性耳聋不仅和先天遗传有关，后天使用氨基糖甙类抗生素会大大增加其外显率。所以线粒体遗传性耳聋的诊断不仅可以用于产前诊断，也可作为表现型正常耳聋家族史成员的筛查，一旦确诊携带突变，应禁止使用氨基糖甙类抗生素，并对其家庭女性成员进行筛查，以指导临床用药，减少线粒体耳聋的发病率。我国线粒体遗传耳聋在遗传性耳聋平均检出率为3.28%[1-2]。目前国外最新的针对耳聋的基因诊断方法是用目标基因捕获法（targetedgenomicenrichmentTGE），大量并行序列测序技术（massivelyparallelsequencingMPS）[3]，这两种方法由于耗时较长，成本高，多用于商业和科研，并不适用于耳聋基因临床快速检测。目前国内可用于耳聋基因诊断方法主要有测序法,限制性酶切片段长度多态性（RFLP），PCR产物单链构象多态性（PCR-SSCP）,变性高效液相色谱法（DHPLC）、质谱法、博奥公司生产的晶芯九项遗传性耳聋基因检测芯片（各方法优劣比较见表1）。其中测序法是基因诊断的金标准，但是设备要求高，步骤繁琐，花费大，一般实验室不能做到，进行多基因分析时，则价格更是昂贵且耗费人力。RFLP原理为将待测的DNA片段用限制性内切酶酶切，以识别并切割特异的序列，将酶切后的产物进行电泳，根据DNA片段的大小来判断目的基因是否会有特异性序列，此方法不需要复杂设备、试剂，但标准化程度差。其他常用技术，如PCR-SSCP和DHPLC等，其特点也是操作繁琐、通量低，限制了耳聋基因诊断的普及。目前国内临床采用的遗传性耳聋的诊断方法主要是博奥公司生产基因芯片检测方法，设备要求高，芯片储存压力大，检测费用贵等而只能在一些大城市的三甲医院或者一些遗传咨询中心进行。这大大限制了遗传性耳聋诊断普及，导致中国大部分地区的散发遗传性耳聋不能得到及时有效的诊断，限制了遗传性耳聋的预防和疗治。参考文献：[1]袁永一，中国人重度-极重度耳聋分子流行病学及致病机制研究.D.中国人民解放军军医进修学院，167,2007.[2]李琦，聋病基因诊断技术研究和应用与非综合征型耳聋的热点突变的分子流行病学研究.D.中国人民解放军军医进修学院，176，2008.[3]A.EliotShearer,RichardJ.H.Smith,Genetics:advancesingenetictestingfordeafness[J].WoltersKluwerHealth.2012,24(6):679-686。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测线粒体突变性耳聋的PCR检测试剂盒。本专利技术所采取的技术方案是：检测线粒体突变性耳聋的PCR引物，该引物序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。检测线粒体突变性耳聋的PCR检测探针，其序列如SEQIDNO:4和SEQIDNO:6所示，或者为该些序列的核苷酸互补序列。进一步的，所述探针还包括SEQIDNO:3和SEQIDNO:5所示的的探针，或者为该些序列的核苷酸互补序列。进一步的，所述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、TexasRed、HEX、VIC、CY3、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种。一种检测线粒体突变性耳聋的PCR检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。进一步的，所述试剂盒还含有上述所述的探针。进一步的，所述试剂盒还含有DNA聚合酶、阴性对照品。本专利技术的有益效果是：1）目前来说耳聋的临床诊断主要是博奥公司生产晶芯九项耳聋基因检测芯片，每个位点检测费用为100元。芯片储存条件要求严格，设备高端，检测步骤繁琐耗时长。而本专利技术是一种简便有效，花费低，准确度高的方法。无需高端设备，所有试剂存放于4摄氏度冰箱即可。单孔同时检测两个位点，只需一步PCR就可以得出结果。两个位点检测费用成本40元左右。2）本专利技术试剂盒及检测方法使得检测快速，准确，花费低，有利于耳聋筛查的普及。3）本专利技术试剂盒及方法检测收集的362份耳聋患者血样，线粒体两个位点的检出率4.69%。这也符合全国线粒体遗传性耳聋的分子流行病学调查数据，与全国平均水平无统计学差异。阳性检出标本经测序验证，与测序结果100%吻合。附图说明图1为线粒体遗传性耳聋Taqman多重荧光定量检测结果图，Allele1表示等位基因1，Allele2表示等位基因2，Heterozygote表示杂合体；图2为线粒体遗传性耳聋Taqman多重荧光定量检测结果图，Allele1表示等位基因1。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明，但并不局限于此。实施例1：检测线粒体突变性耳聋的PCR引物及探针本专利技术前期通过引物设计原则并结合实际情况，设计出大量检测线粒体突变性耳聋相关DNA的PCR引物，然后通过大量实验研究筛选出高灵敏和高特异性的引物序列和检测探针，最终选取检测线粒体突变性耳聋相关DNA效果最佳的PCR引物及探针，其核苷酸序列分别如下所示：引物：F：5’-GTGCTTAGTTGAACAG-3’（SEQIDNO:1），R：5’-CACTTTCCAGTACACTTA-3’（SEQIDNO:2）。探针：P1：CY3-CCCGTCACCCTCCTCA-BHQ2（SEQIDNO:3）；P2：TexasRed-CCCGTCACTCTCCTCA-BHQ2（SEQIDNO:4）；P3：FAM-TTATATAGAGGAGACAAGTCGTA-BHQ（SEQIDNO:5）；P4：CY5-TTATATAGAGGAGGCAAGTCGTA-BHQ2（SEQIDNO:6）；实施例2：检测线粒体突变性耳聋的PCR检测试剂盒检测粒体突变性耳聋的PCR检测试剂盒包括以下成份：1）含有实施例1中所述的引物；2）含有实施例1中所述的检测探针：3）PCR反应液：BIO-RADIQTMMultiplexPowermix(catalog#172-5848)美国伯乐公司4）还本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测线粒体突变性耳聋的PCR引物，该引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.检测线粒体突变性耳聋的PCR引物，该引物序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。
2.检测线粒体突变性耳聋的PCR检测探针，其序列如SEQIDNO:4和SEQIDNO:6所示，
或者为该些序列的核苷酸互补序列。
3.根据权利要求2所述的检测线粒体突变性耳聋的PCR检测探针，其特征在于：所述探
针还包括SEQIDNO:3和SEQIDNO:5所示的的探针，或者为该些序列的核苷酸互补序列。
4.根据权利要求2或3所述的检测线粒体突变性耳聋的PCR检测探针，其特征在于：探针
序列5’端标记的荧光基...
【专利技术属性】
技术研发人员：石玉玲，曹诚，李林海，张亚松，熊敏，王岳彤，陈建芸，廖扬，
申请(专利权)人：石玉玲，
类型：发明
国别省市：广东;44
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