无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于转基因作物检测的无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法，涉及生物工程技术领域中DNA检测方法。所述的转基因作物包括转基因水稻、玉米、油菜和大豆；所述的方法是：①收集序列；②利用上述序列特征设计引物；③PCR扩增。本发明专利技术避免了TaqMan荧光定量PCR必须包含2条引物1条探针从而使最短检测靶标很难达到35-45bp的问题；避免了染料法荧光定量PCR在产物过短情况下很难区分PCR产物和引物二聚体的问题；适用于转基因水稻、油菜、大豆和玉米作物中短片段DNA的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
中DNA检测方法，尤其涉及一种无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法，用于短片段DNA检测。
技术介绍
近年来，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获准种植和生产。这些转基因作物在被加工成食品、饲料的同时也产生了大量的深加工转基因产品和加工废弃物。由于转基因产品的生态安全和食用安全一直备受争议，30多个国家和地区相继实施转基因产品标识制度。这就使对于转基因深加工产品和加工废弃物中小片段转基因成分的检测方法的研究显得格外重要。目前，已有许多研究者致力于对深加工产品成分鉴定=Breton等通过简单重复序列的扩增片段多态性、Pafundo等则通过扩增片段长度多态性，检测食用油中的橄榄油成分(Breton等，2004 ;Pafundo等，2005) ；Bai等通过将PCR与芯片杂交技术相结合，快速鉴定植物油中的花生、棉花、油棕、芝麻、玉米、向日葵成分(Bai 等,2011) ；Zhou等利用磁珠法富集DNA片段，然后通过突光关联光谱法(Fluorescence cross-correlation spectroscopy),利用P-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于转基因作物检测的无探针双引物标记交互荧光能量共振转移定量PCR方法，其特征在于：所述的转基因作物包括转基因水稻、玉米、油菜和大豆；①收集序列收集转基因作物内标准基因以及外源基因的序列；②利用上述序列特征设计引物利用上述转基因作物内标准基因以及外源基因的序列分别设计扩增片段长度在35?45bp的引物组合；并在上游引物靠近3“端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6?carboxy?fluorescein?(FAM)，对应下游引物靠近3“端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团?tetramethyl?6?carboxyrhodamine?(TAMRA)；③PCR扩增以含有内标准基因和外源基因的转基因作物...

【技术特征摘要】
1.一种适用于转基因作物检测的无探针双引物标记交互荧光能量共振转移 定量PCR方法，其特征在于 所述的转基因作物包括转基因水稻、玉米、油菜和大豆； ①收集序列 收集转基因作物内标准基因以及外源基因的序列； ②利用上述序列特征设计引物 利用上述转基因作物内标准基因以及外源基因的序列分别设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合； 并在上游引物靠近3’端的胸腺卩密唳碱基处标记突光基团6-carboxy-fluorescein(FAM)，对应下游引物靠近3’端的胸腺嘧啶碱基处标记淬灭基团tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)； ③PCR扩增 以含有内标准基因和外源基因的转基因作物为研究模板，分别利用上述引物组合进行荧光定量PCR扩增；转基因作物基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应，并在延伸步骤后记录荧光信号强度的变化，随着PCR产物的积累，荧光信号会逐渐降低至设定的阈值。2.基于权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于适用于转基因水稻检测的定量PCR方法 ①收集序列 收集水稻内标准基因PLD和转基因水稻TT51-1转化事件所含CrylAc基因的序列； ②利用上述序列特征设计引物 设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合PLDF2714F/PLDR2755T 和 BtTT51F1140F/BtTT51R1180T ； 引物序列分别为PLDF2714F gctgggaggacgtgtTcg,PLDR2755T ggtgcttggcgttgcTga,BtTT51F1140F aacagagttcgcctaTgga,BtTT51R1180T cggatggcaagtTagaagagg ； 并在上述引物PLDF2714F和BtTT51F1140F靠近3’端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-fluorescein (FAM)，对应下游引物 PLDR2755T 和 BtIT51R1180T 靠近 3’ 端的胸腺喃唳喊基处标记淬灭基团 tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA)； 该引物组合PLDF2714F/PLDR2755T在水稻内标准基因PLD序列中的位置如图1所示；引物组合BtTT51F1140F/BtTT51R1180T在转基因水稻TT51-1转化事件所含CrylAc基因的序列中的位置如图2所示； ③PCR扩增 以含有水稻内标准基因PLD和水稻外源TT51-1转化事件的转基因水稻TT51-1为研究模板，分别利用上述引物组合PLDF2714F/PLDR2755T和BtIT51F1140F/BtTT51R1180T进行荧光定量PCR扩增；转基因水稻TT51-1基因组DNA被水稀释至不同含量，进行荧光定量PCR反应。3.基于权利要求1所述的定量PCR方法，其特征在于适用于转基因油菜检测的定量PCR方法 ①收集序列 收集油菜内标准基因CruA的序列； ②利用上述序列特征设计引物 设计扩增片段长度在35-45bp的引物组合BnCruAF1635F/BnCruAR1679T ； 引物序列分别为BnCruAF1635F :gatgacccatctaatgcTgacg，BnCruAR1679T :gtaaccgagctgtggcttgTa， 并在上述引物BnCruAF1635F靠近3’端的胸腺嘧啶碱基处标记荧光基团6-carboxy-f luorescein (FAM),对应下游引物BnCruAR1679T靠近3’端的胸腺卩密唳碱基...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴刚，李伟，李晓飞，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：