本发明专利技术提供了一种Q热贝纳柯克斯体Taqman荧光定量PCR检测方法，其上游引物为：5’-GGGGTAAAGTGATCTACAC-3’；下游引物为：5’-CCCATAAACGTCCGATAC-3；探针为：5’-TCAGTATGTATCCACCGTAGCCA-3；其中所述探针的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。本发明专利技术建立了可以简便快速、准确检测Q热贝纳柯克斯体的荧光定量PCR检测方法，有利于区分Q热贝纳柯克斯体和其他病原体，对人和动物Q热诊断具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种Q热贝纳柯克斯体检测方法，具体地说，涉及一种。
技术介绍
Q热(Q fever)是由贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)感染所致的一种人兽共患的自然疫源性疾病，该病被国际动物卫生组织(Office International Des Epizooties,0IE)定为B类动物传染病，我国将其列为二类动物疫病。贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)是Q热的病原体，也是重要的生物战剂和生物恐怖剂，其主要通过呼吸道以气溶胶形式进入体内引起人和动物感染。Q热一般无特异性临床症状，确诊主要依靠实验室检查，包括血清学检测和病原的分离与鉴定。特异性抗体的检出一般在发病2周以后，所以血清学检测不能用于Q热感染的早期诊断。由于贝纳柯克斯体不能在人工培养基上生长，需要靠动物接种、细胞培养等对贝纳柯克斯体病原进行分离。贝纳柯克斯体病原分离操作复杂，费时费力且成功率低。聚合酶链式反应(PCR)是上个世纪90年代发展起来的一种简便、敏感、特异的检测病原体的分子生物学检测方法，也在Q热贝纳柯克斯体感染诊断中应用。目前，贝纳柯克斯体的快速检测与鉴定主要方法有Maurin，Μ.和Raoult，D.的PCR法，研究者根据16SrRNA、ISlllla以及coml、sod与16S rDNA特异性基因设计引物，广泛应用于PCR检测哺乳动物、节肢动物及患者等各种标本的Q热病原体。但是传统的PCR技术在应用中还存在着不足，一是不能准确定量，二是容易交叉污染，产生假阳性。 实时荧光定量PCR(real-time PCR)则可以结合传统PCR的优点并克服不足，实现检测结果和检测样品之间的定性和定量关系，从而可以根据需要对样品进行准确定量。另夕卜，该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。实时荧光定量PCR最突出的优点就是可以对核酸样品进行精确定量。TaqMan探针技术是由美国Perkin Elmer (PE)公司研发的一种实时PCR技术，它在一条20 24bp左右的寡核苷酸探针的5'端标记突光报告基团(Reporter, R) ,3'端标记突光淬灭基团(Quencher, Q)，其序列与两引物包含序列内的一段DNA模板完全互补。当这条探针保持完整时，Q和R基团由于距离很近(7 10nm)，Q基团将淬灭R基团发出的荧光信号，即报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸收。PCR反应后，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针结合位置，发挥其5' -3'外切核酸酶活性，将荧光探针切断，Q基团由于距离较远而失去对报告荧光的淬灭作用，R基团的荧光信号得以释放而被检测仪所捕获。如果在PCR过程中，探针序列与模板序列不能互补，探针仍然是游离的，未杂交的探针仍然保持完整，荧光信号也就不能被检测到，从而保证了扩增的特异性。模板每复制一次，就有一次荧光信号的释放，通过该技术可以对模板进行准确定量。常用的荧光报告基团有FAM、JOE、HEX、Texas-Red 等，淬灭基团有 TAMRA, Eclipse 等。由于采用了荧光和淬灭基团双末端标记，因此淬灭难以彻底，本底较高。针对此问题，2000年美国ABI公司推出了一种新的TaqMan-MGB探针。探针3’端采用了非荧光性的淬灭基团，吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。同时探针上还连接有MGB(minor groove binder)修饰基团,可以将探针Tm值提高10°C左右。使得较短的探针同样能达到较高的Tm值并且短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高。另外，较短的探针也降低了成本，还使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。目前，在国内外已有应用于贝纳柯克斯体的诊断、疗效评价、药敏试验以及乳制品的质量监测。Klee等人应用此法与IFA法、capture ELISA、普通PCR法、巢式PCR相比较说明荧光定量PCR的结果更加客观可靠，重复性好，灵敏度高，特异性好，操作简单，污染少，耗时短。张晶波等人根据贝氏柯克斯体特异的23S rRNA插入基因序列(interveningsequence, IVS)设计引物和探针，以克隆的23S rRNA插入基因片段作DNA模板，在荧光定量检测仪上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系；与套式PCR相比较，荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体，检出结果均为O。亚红祥等人根据贝纳柯克斯体ISlllla基因设计引物和探针，以克隆的ISlllla基因片断(485bp)作标准DNA模板，建立实时荧光定量PCR检测方法，并与普通巢式PCR方法进行比较。结果实时荧光定量PCR的灵敏度为巢式PCR的10倍。但是由于PCR是一种敏感的定性检测方法，如检测样本或试剂受到微量目的DNA污染后很容易产生假阳性结果，严重影响检测结果的可靠性。因此，急需建立快速、敏感、稳定可靠的Q热贝纳柯克斯体特异性检测方法。由于TaqMan荧光定量PCR技术具有特异性强、操作简便等优点，近年来在研究领域被广泛采用，本研究拟运用实时荧光定量PCR技术建立检测贝纳柯克斯体的TaqMan探针法为Q热贝纳柯克斯体检测试剂盒`的研发奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供Q热贝纳柯克斯体Taqman荧光定量PCR检测方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一种Q热贝纳柯克斯体Taqman荧光定量PCR检测用引物及探针，其上游引物为:5 ’ -GGGGTAAAGTGATCTACAC-3 ’ ;下游引物为:5’ -CCCATAAACGTCCGATAC-3 ;探针为:5’ -TCAGTATGTATCCACCGTAGCCA-3 ;所述探针的 5’ 端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。其中，所述的报告荧光染料为报告荧光染料FAM，淬灭荧光染料为淬灭荧光染料Eclipse。本专利技术还提供含有上述弓I物及探针的检测试剂盒。本专利技术进一步提供利用上述引物及探针检测Q热贝纳柯克斯体的方法，包括以下步骤:I)目的基因的扩增以Q热贝纳柯克斯体基因组DNA为模板，进行PCR反应，回收PCR扩增产物；2)目的基因的克隆将步骤I)的目的基因连接在PGEM-T easy载体上并转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，进行PCR检测并测序，提取阳性重组质粒，计算重组质粒的拷贝数；3) Taqman荧光定量PCR检测以阳性重组质粒DNA为模板，利用引物及探针，其中，上游引物为:5’ -GGGGTAAAGTGATCTACAC-3’;下游引物为:5’ -CCCATAAACGTCCGATAC-3 ;探针为:5’ -FAM-TCAGTATGTATCCACCGTAGCCA-Eclipse-3，进行 Taqman 荧光定量 PCR 检测。上述方法，所述Taqman荧光PCR扩增条件为95°C预变性3min ;然后采用二步法进行反应:95°C,15s ；60本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Q热贝纳柯克斯体Taqman荧光定量PCR检测用引物及探针，其上游引物为：5’‑GGGGTAAAGTGATCTACAC‑3’；下游引物为：5’‑CCCATAAACGTCCGATAC‑3’；探针为：5’‑TCAGTATGTATCCACCGTAGCCA‑3’；所述探针的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贾广乐，林祥梅，韩雪清，王晓楠，梅琳，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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