使用切口酶的解旋酶依赖性等温扩增制造技术

本发明专利技术涉及用于扩增模板核酸的方法，其中所述方法包括在切口核酸内切酶存在下使用解旋酶依赖性扩增（HDA）反应扩增所述模板核酸，并且其中所述模板核酸包含由所述切口核酸内切酶识别的序列，或者在HDA反应期间由所述切口核酸内切酶识别的序列被引入到模板核酸中。本发明专利技术还涉及用于扩增核酸的试剂盒，所述试剂盒包含切口核酸内切酶、解旋酶和DNA聚合酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于生物学和化学领域，特别是属于分子生物学领域。更具体地，本专利技术涉及用于扩增核酸的方法和试剂盒。
技术介绍
核酸扩增被广泛用在研究、诊断学、法医学、医学、食物科学和农业中。“现场即时测试(Point of Care Testing)”(POCT)是指在患者医疗点处或附近进行的诊断性测试，即去集中化的检查，例如可以在私人医疗实践、小医院、药店中或者甚至在事故或其它医疗紧急事件的现场或位点处或者在救护车内执行所述检查。现场即时诊断需要快速且简单的测试。因此，在基于核酸的检测方法的情况下，与已建立的但较慢的基于PCR的方法相比，快速等温扩增技术最近已变得越来越重要。PCR需要热循环，以便将双链核酸例如DNA的两条链分离开。相反，例如等温扩增方法不需要热循环仪。最杰出的等温扩增方法之一是所谓的解旋酶依赖性扩增(HDA)(例如被描述在Vincent 等.(2004)，EMBO re ports 5(8):795-800 Jeong 等.(2009)，Cell.Mol.Life Sci66:3325-3336 ；W0-A2 2004/027025 ；W0-A2 2006/074334 中，所有均通过参考结合于此)。HDA是基于解旋酶将双链核酸特别是DNA解旋的能力，而不需要加热或甚至热循环。在HDA中，使用DNA聚合酶和合适的寡核苷酸引物来复制分离的DNA链。因此，HDA模拟天然的复制叉机制。HDA需要存在ATP、二价镁离子和dNTP。某些基于HDA的方法还采用单链结合蛋白(SSB)来包被置换的DNA链。事实上，取决于所使用的酶，可以在热不稳定或热稳定的反应中执行HDA方法。典型地，在25°C和50°C之间、优选在37°C和42°C之间的温度下执行热不稳定的HDA反应。相反，在超过50°C、典型地在60°C和70°C之间的温度下执行热稳定的HDA或嗜热的HDA (tHDA)反应。HDA反应选择性地扩增由两个引物限定的靶序列。HDA使用解旋酶而不是像PCR中那样使用热来将双链核酸的两条链分离开。因此，可以在单个温度下执行HDA，而不需要热循环。常规的标准HDA反应的步骤示于图1中:在第一个步骤中，通过解旋酶将双链核酸解旋，产生(部分)单链的序列。然后，引物与单链区结合。在步骤2中，聚合酶合成互补链。最后，解旋酶和聚合酶共同起作用，导致模板的扩增(步骤3)。其它等温扩增包括链置换扩增(SDA)，链置换扩增是基于使用限制性酶在DNA的未修饰链上造成切口并通过核酸外切酶缺陷的DNA聚合酶的作用来延伸切口处的3’末端以置换下游的DNA链。另一种等温扩增是滚环扩增(RCA)，其中线性ssDNA被退火到环状ssDNA模板上，所述环状ssDNA模板是通过使用DNA连接酶连接模板DNA的两个末端而生成的。接着，使用DNA聚合酶延伸退火的引物，并生成互补模板序列的串联连接的拷贝。RCA和SDA两者都需要初始的热变性步骤。其它等温扩增包括例如切口酶扩增反应(NEAR)和相关的指数扩增反应(EXPAR)，两者都采用切口酶和聚合酶来扩增短的双链模板序列(例如被描述在van Ness等.(2003)，Proc.Natl.Acad.Sc1.100(8):4504-4509 ;US-A1 2003/0082590 ；W0-A22004/022701 ；W0-A22009/012246 ；W0-A2 2004/067726 中，所有均通过参考结合于此)。然而，所有上述等温扩增方法均需要复杂的反应方案，是相对慢的和/或仅限于相对短的模板序列。
技术实现思路
本专利技术提供了用于扩增核酸、优选双链核酸的改进的方法，所述方法克服了现有技术的这些限制。本专利技术的方法基于改良的HDA方法。所提供的方法比常规的tHDA快，同时具有可靠的特异性。与类似于NEAR和EXPAR的方法相比，本专利技术的方法可以扩增更长的模板核酸。本专利技术涉及在切口核酸内切酶存在下执行的HDA扩增方法。因此，在本专利技术的情形下，在解旋酶、合适的聚合酶、和切口核酸内切酶存在下扩增模板核酸。具体地，本专利技术涉及用于扩增模板核酸、特别是DNA的方法，其中所述方法包括在切口核酸内切酶存在下使用解旋酶依赖性扩增(HDA)反应、特别是嗜热的HDA (tHDA)扩增所述模板核酸，并且其中所述模板核酸包含由所述切口核酸内切酶识别的序列，或者在HDA反应期间由所述切口核酸内切酶识别的序列被弓I入到模板核酸中。可以使用包含由切口核酸内切酶识别的序列的寡核苷酸引物将由切口核酸内切酶识别的序列引入到模板核酸中。这样的引物可以包含不与模板核酸杂交但是包含由切口核酸内切酶识别的序列或其部分的5’标签序列。本专利技术还涉及用于扩增核酸的试剂盒，所述试剂盒包含-切口核酸内切酶，-解旋酶，和`-DNA 聚合酶。本专利技术的方法和试剂盒可用于扩增核酸，也可用于检测核酸和/或对核酸进行定量。附图说明图1示出了现有技术的且可商购的例如来自于biohelix/ New England Biolabs的标准tHDA反应、即在切口核酸内切酶不存在下的tHDA反应的方案。图2示出了本专利技术的使用带标签引物的切口 tHDA的具体实施方案的反应方案。图3示出了本专利技术的使用不带标签引物的切口 tHDA的具体实施方案的反应方案。图4示出了在管扫描器中来自于实施例1的不同的实时(切口)tHDA反应的结果(扩增曲线)。图中所示的是随时间推移的原始荧光强度。图5示出了实施例1的扩增产物的熔融曲线。A)标准tHDA，B)无Nb.BsmI的切口 tHDA，C)有 Nb.BsmI 的切口 tHDA。图6示出了具有扩增和电泳后的实施例1的各个反应混合物的聚丙烯酰胺凝胶。A)染色前的凝胶，B)用EtBr染色后的凝胶。C)凝胶上各个条带BI至B5的内含物还被图示在图6B1至6B5中。图7示出了实施例2的靶DNA连同所使用的引物的序列。图8示出了反应速率对切口核酸内切酶的浓度的依赖性。图中示出的是在可以检测到显著高于背景信号的扩增子信号之前的以分钟(min)为单位的时间。在存在较低浓度的切口核酸内切酶时，比无切口核酸内切酶的反应早约5min检测到信号，表示反应更快。图9示出了标准tHDA即无任何切口核酸内切酶的tHDA的扩增曲线(随时间推移的荧光)。在cDNA模板存在下测得三条曲线，在cDNA模板不存在下测得两条曲线。图10示出了在0.1U切口核酸内切酶Nt.BstNBI存在下tHDA的扩增曲线。在cDNA模板存在下测得三条曲线，在cDNA模板不存在下测得两条曲线。图11示出了在无切口核酸内切酶Nt.BstNBI的标准tHDA之后的熔融曲线分析。对图9中示出的反应进行熔融曲线分析。在cDNA模板存在下测得三条曲线，在cDNA模板不存在下测得两条曲线。图12示出了在0.1U切口核酸内切酶Nt.BstNBI存在下标准tHDA之后的熔融曲线分析。对图10中示出的反应进行熔融曲线分析。在CDNA模板存在下测得三条曲线，在cDNA模板不存在下测得两条曲线。图13示出了反应速率对切口核酸内切酶的存在的依赖性。图中示出的是在可以检测到显著高于背景信号的扩增子信号之前的以分钟(min)为单位的时间。在切口核酸内切酶存在下，比无切口核酸内切酶的反应早约6min检测到信号，表示反应更快本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于扩增模板核酸的方法，其中所述方法包括在切口核酸内切酶存在下使用解旋酶依赖性扩增（HDA）反应扩增所述模板核酸，并且其中所述模板核酸包含由所述切口核酸内切酶识别的序列，或者在HDA反应期间由所述切口核酸内切酶识别的序列被引入到模板核酸中，其中HDA反应是嗜热的HDA（tHDA），其中使用包含由切口核酸内切酶识别的序列的寡核苷酸引物将由切口核酸内切酶识别的序列引入到模板核酸中，并且其中扩增的序列短于400bp。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯蒂安·科夫哈格，戈尔德·格洛豪瑟，托马斯·罗特曼，拉尔夫·希默尔赖希，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE