本发明专利技术公开了确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒以及引物。其中，该方法包括：利用第一引物和第二引物对核酸样本进行PCR扩增，并且在PCR扩增体系中加入核酸探针，核酸探针对应两个预定位点之间至少一部分对应的核酸序列；检测反应体系的发光，以便确定核酸样本的预定位点是否存在已知突变，第一引物的近3’端包含与两个预定位点之一已知突变对应的碱基，第二引物的近3’端包含与另一个已知突变对应的碱基，核酸探针具有：发光基团，发光基团形成于核酸探针的5’端，调节基团，调节基团形成于核酸探针的3’端，并且调节基团可以调节发光基团的发光。利用该方法能够有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学领域。具体而言，本专利技术涉及确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒以及引物。
技术介绍
ApoE是一种载脂蛋白，其遗传多态性主要受控于两个SNP位点rs429358和rs7412，这两个SNP位点通过不同的核酸组合决定了 ApoE的三种等位基因型:ε 2(rs429358 为 T, rs7412 为 T)、ε 3 (rs429358 为 Τ, rs7412 为 C)、ε 4 (rs429358 为 C,rs7412为C)，这三种类型等位基因分别编码三种ApoE蛋白亚型，即ApoE2 (其蛋白序列的112位和158位均为半胱氨酸)、ApoE3 (其蛋白序列的112位为半胱氨酸，158位为精氨酸)、ApoE4 (其蛋白序列的112位和158位均为精氨酸)。因此，ApoE基因有ε 2/ ε 2、ε 3/ε3、和ε 4/ε 4三种纯合子型与ε 2/ε 3、ε 2/ε 4和ε 3/ε 4三种杂合子型。目前ApoE基因分型的方法主要有:传统DNA测序法、等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法、聚合酶链反应-单链构象多态性法、聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性法、多重扩增受阻突变体系PCR技术法、高分辨率溶解曲线法以及双色荧光分子探针法等。然而，目前确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出了可以有效确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法。在本专利技术的一 个方面，本专利技术提出了一种确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法。根据本专利技术 的实施例，该方法包括:利用第一引物和第二引物对所述核酸样本进行PCR扩增，并且在所述PCR扩增体系中加入核酸探针，所述核酸探针对应两个预定位点之间至少一部分的核酸序列；以及检测反应体系的发光，以便确定所述核酸样本的预定位点是否存在已知突变，其中，所述第一引物的近3’端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3’端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应的碱基，所述第一引物和第二引物之一作为正向引物，所述第一引物和所述第二引物的另一个作为反向引物，所述核酸探针具有:发光基团，所述发光基团形成于所述核酸探针的5’端，调节基团，所述调节基团形成于所述核酸探针的3’端，并且所述调节基团可以调节所述发光基团的发光。根据本专利技术实施例的方法，能够通过检测PCR扩增体系所产生的荧光，有效地确定所检测的核酸样本的两个预定位点同时存在相应的已知突变，并进一步可以有效地确定ApoE的等位基因分型，对于老年痴呆症及心脑血管等与ApoE基因型相关疾病的预防、早期诊断以及疾病预后具有非常重要的意义。根据本专利技术的一些实施例，上述确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法还可以具有下列附加技术特征:根据本专利技术的一个实施例，所述核酸样本来源于人体组织或细胞、重组核酸或转基因生物组织细胞，优选地采用人类全基因组DNA。根据本专利技术的实施例，可以对上述来源的核酸样本进行有效地确定突变类型，从而可以对提供核酸样本的个体进行有效地分析。根据本专利技术的一个实施例，所述预定位点是SNP rs429358和rs7412。由此，利用根据本专利技术实施例，可以有效地确定核酸样本中在两个预定位点SNP rs429358和rs7412是否具有已知突变，从而可以有效地确定ApoE等位基因分型。根据本专利技术的一个实施例，所述第一引物的近3’端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3’端包含与rs7412的已知突变对应的碱基。由此，利用根据本专利技术实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法对核酸样本进行检测，在PCR反应时引物可以与模板按照碱基配对原则选择性结合，从而可以特异地扩增出ApoE的不同等位基因，并进一步可以有效地确定ApoE等位基因的类型。根据本专利技术的一个实施例，所述第一引物的3’端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的3’端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基。根据本专利技术的一个实施例，所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物。根据本专利技术的一个实施例，所述第一引物为选自下列的至少之一:5’ -CGGACATGGAGGACGTGT-3’，5’ -GCGGACATGGAGGACGTGT-3’，5’ - CGCGGACA TGGAGGA CGTGT - 3’，5’ -CGGACATGGAGGACGTGC-3> , - GCGGA CA TGGAGGA CGTGC - 3’，5’ -CGCGGACATGGAGGACGTGC-3’。所述第二引物为选自下列的至少之一:5’ -TGGTACACTGCCAGGCA-3’，5’ -CTGGTACACTGCCAGGCA-3’，5’ -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3’，5，-TGGTACACTGCCAGGCG-3，，5，-CTGGTACACTGCCAGGCG-3，，5，-CCTGGTACACTGCCAGGCG-3，。由此，利用根据本专利技术实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法对核酸样本进行检测，在PCR反应过 程中，引物可以与模板按照碱基配对原则选择性结合，从而可以特异地扩增出ApoE的不同等位基因，并进一步可以有效地确定ApoE等位基因的类型。根据本专利技术的一个实施例，所述核酸探针的长度为20个核苷酸。根据本专利技术的一个实施例，所述核酸探针的序列为5’-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3’。根据本专利技术的一个实施例，所述核酸探针的发光基团为荧光基团。根据本专利技术的一个实施例，所述荧光基团为FAM。根据本专利技术的一个实施例，所述调节基团为淬灭基团。根据本专利技术的一个实施例，所述淬灭基团为BHQ1。由此，利用根据本专利技术实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法对核酸样本进行检测，通过检测各基因型对应的扩增体系中有无荧光信号，即可判断待测样品中是否含有该亚型的ApoE基因。在本专利技术的又一个方面，本专利技术提出了一种确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的试剂盒。根据本专利技术的实施例，所述试剂盒可以应用于前面所述的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法。由此，利用根据本专利技术实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的试剂盒对核酸样本进行检测，可以有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变，并进一步可以有效地确定ApoE的等位基因分型，对于老年痴呆症和心脑血管疾病的预防以及早期诊断具有非常重要的意义。另外，前面针对确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法所描述的特征和优点，也当然地适用该试剂盒，不再赘述。在本专利技术的又一个方面，本专利技术提出了一组确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的PCR引物。根据本专利技术的实施例，所述PCR引物可以应用于前面所述的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法以及试剂盒。由此，PCR扩增过程中引物可以与模板按照碱基配对原则选择性结合，PCR扩增可以按照预定方向进行有效扩增，并且能够特异地扩增出不同等位基因。另外，前面针对确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，其特征在于，包括：利用第一引物和第二引物对所述核酸样本进行PCR扩增，并且在所述PCR扩增体系中加入核酸探针，所述核酸探针对应两个预定位点之间至少一部分的核酸序列；以及检测反应体系的发光，以便确定所述核酸样本的预定位点是否存在已知突变，其中，所述第一引物的近3’端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3’端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应的碱基，所述第一引物和第二引物之一作为正向引物，所述第一引物和所述第二引物的另一个作为反向引物，所述核酸探针具有：发光基团，所述发光基团形成于所述核酸探针的5’端，调节基团，所述调节基团形成于所述核酸探针的3’端，并且所述调节基团可以调节所述发光基团的发光，任选地，所述核酸样本来源于人体组织或细胞、重组核酸或转基因生物组织细胞，任选地，所述预定位点是SNP rs429358和rs7412，任选地，所述述第一引物的近3’端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3’端包含与rs7412的已知突变对应的碱基，任选地，所述第一引物的3’端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的3’端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基，任选地，所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物，任选地，所述第一引物为选自下列的至少之一：5’‑CGGACATGGAGGACGTGT‑3’5’‑GCGGACATGGAGGACGTGT‑3’5’‑CGCGGACATGGAGGACGTGT‑3’5’‑CGGACATGGAGGACGTGC‑3’5’‑GCGGACATGGAGGACGTGC‑3’5’‑CGCGGACATGGAGGACGTGC‑3’，所述第二引物为选自下列的至少之一：5’‑TGGTACACTGCCAGGCA‑3’5’‑CTGGTACACTGCCAGGCA‑3’5’‑CCTGGTACACTGCCAGGCA‑3’5’‑TGGTACACTGCCAGGCG‑3’5’‑CTGGTACACTGCCAGGCG‑3’5’‑CCTGGTACACTGCCAGGCG‑3’，任选地，所述核酸探针的长度为20个核苷酸。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许华曦，卜国军，张含，张云武，刘家珍，
申请(专利权)人：厦门人瑞生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35
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