本发明专利技术公开了一种检测仔猪脐带血中猪等孢球虫的实时荧光PCR试剂盒及其用途。该试剂盒是首次根据猪等孢球虫18SrRNA基因而研制的实时荧光PCR试剂盒，包括针对猪等孢球虫18SrRNA基因序列设计的Taqman荧光探针及引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2所示，所述荧光探针的序列如SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术的试剂盒能够特异性地检测仔猪脐带血中的猪等孢球虫，并具有较高的灵敏度，特异性强和重复性优，可以实现大通量样品的检测。并且本发明专利技术的试剂盒检测结果快速高效，不会造成样品交叉污染，同时达到母仔猪同时监测的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子诊断
，特别涉及一种检测仔猪脐带血中猪等孢球虫的实时荧光PCR试剂盒及其用途。
技术介绍
猪等孢球虫病是由等孢球虫(Isosporasuis)寄生于猪小肠上皮细胞而引起的一种原虫病。猪等孢球虫是引起哺乳仔猪和断奶后仔猪球虫病的主要病原。它通常感染5-14日龄的仔猪，临床上以剧烈性黄痢、抗菌素治疗无效为特征。猪等孢球虫病主要发生在密集饲养猪场的仔猪群中，主要对仔猪的致病性最强，主要表现为腹泻、食欲减退和体重下降等临床症状，严重者可导致死亡。成年猪、经产母猪或产房母猪多为阴性感染或带虫宿主，不表现临床症状，但多为本病的传染源。猪等孢球虫病不论是规模化方式饲养的猪，还是散养的猪都有可能发生，猪等孢球虫常常与轮状病毒和大肠杆菌等病毒、细菌混合感染，致使猪病发生更为复杂，防治难度更大，严重制约着养猪业的发展。并且预防和治疗用药方面的成本较高，给养猪业造成严重的经济损失。长期以来，猪球虫病诊断主要通过临床症状和病原学诊断，主要依靠传统的卵囊结构、形态大小、致病性、寄生部位、肠道病变特征等指标。一般是对存在临床症状的仔猪粪便进行粪便学检查，检查到卵囊即可确诊。粪便学检查包括直接涂片法、离心沉淀法、漂浮法、染色法、荧光显微镜检查法和PCR方法等。但这种分类方法主观性较强，对研究者的个人经验及技能有很大的依赖性，且等孢球虫和各种艾美耳球虫的孢子化卵囊差异很小，使猪等孢球虫的分类比较困难。粪便学检查最常用的是显微镜观察，但如何确定是否为猪等孢球虫感染则要进行孢子化，所需时间较长。传统猪等孢球虫分离鉴定方法费时力，检出率低，易出现假阳性，获得可靠的检测结果比较困难。PCR诊断方法具有高度的特异性和敏感性，可用于大量样品检测，也可用于粪便中卵囊量较少的无症状带虫者或轻微症状病例的诊断。实时荧光定量PCR技术(real-timefluorescencequantitativePCR，QPCR)是在常规PCR技术的基础上发展起来的一种较新的核酸检测技术，具备快速、特异性更强、准确性和灵敏度更高的特点，具有实时性，2-3小时便能得出结果，且不需要PCR后处理，有效降低了实验过程中的污染。脐带是哺乳类动物连接胎儿和胎盘的管状结构，由两条动脉和一条静脉构成，是连接母体和子体的天然通道。脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，在胎盘屏障的作用下大分子物质通常不能从母体进入脐带血中，因此健康仔猪脐带血中不含有任何抗体，但病毒、内毒素等小分子颗粒能够透过胎盘屏障进入脐带血中，从而垂直传播给仔猪。猪脐带血检测技术具有采样方便、安全省时、不影响生产等优点。结合仔猪脐带血检测的优势，实时荧光PCR检测结果可同时反映母猪、仔猪等孢球虫感染状况，可对猪群中猪等孢球虫感染情况进行早期预警评判，进一步有助于猪场做好猪等孢球虫的防控工作，降低养殖风险。因此，研制一种检测仔猪脐带血中等孢球虫的实时荧光PCR方法，并基于此方法开发检测试剂盒非常有必要，且应用前景广阔。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种检测仔猪脐带血中猪等孢球虫的实时荧光PCR试剂盒。该试剂盒具有灵敏度高、特异性好、重复性优、检测结果快速客观准确等优点，能同时反映母、仔猪中猪等孢球虫感染状况，有益于对猪群中猪等孢球虫感染情况的早期预警评判，进一步有助于猪场做好该疾病的防控工作。基于上述目的，本专利技术提供了一种检测仔猪脐带血中猪等孢球虫的实时荧光PCR试剂盒，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：上游扩增引物：5’-ATAGTAACCGAACGGATCGC-3’，其为SEQIDNO:1序列；下游扩增引物：5’-CGTCGAAAGCTGATAGGTCA-3’，其为SEQIDNO:2序列；特异性荧光探针：FAM-5’-TTGAATGATCCATCGCCGGC-3’-TAMARA，其为SEQIDNO:3序列，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因。合理的引物和荧光探针设计是成功应用实时荧光PCR技术的关键。引物和探针的特异性对反应有很大影响，如果引物和探针特异性不高，可能在扩增构成中产生非靶标条带，影响检测结果的判定。本专利技术从猪等孢球虫全长18SrRNA基因上筛选出一段基因片段，该基因片段在猪等孢球虫中非常保守，大小为77bp，专利技术人针对该保守片段设计了多对引物和探针，最终根据扩增效果(扩增效率、灵敏度等)筛选出本专利技术的引物和探针。试验结果表明，本专利技术引物和探针的特异性强，能有效从脐带血、血液与组织样品中检测到猪等孢球虫核酸。在本专利技术中，优选的，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为1:1:1。在本专利技术中，优选的，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针在所述试剂盒中的终浓度均为0.2～0.4μM。在本专利技术中，优选的，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光PCR反应液(含酶)及说明书。在PCR反应体系中加入荧光PCR反应液，该反应液中含有UNG酶系统，在扩增环节可以有效解决扩增污染现象，抗污染能力强等。本专利技术的荧光PCR反应液中还含有dNTPs、TaqDNA聚合酶和一些增强成分(MgCl2、DMSO或甲酰胺)的混合物，具体的增强成分根据实际需要进行添加。在本专利技术中，优选的，所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O，所述阳性对照为含有猪等孢球虫18SrRNA基因序列的克隆质粒P-I.suis-18S，克隆质粒P-I.suis-18S的终浓度为1×105copies/μL～1×107copies/μL。在本专利技术中，优选的，所述猪等孢球虫18SrRNA基因的核苷酸序列如下所示：ATAGTAACCGAACGGATCGCGTTATGGCTTCGGCCGGCGATGGATCATTCAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTCGACG，其为SEQIDNO:4所示。在本专利技术中，优选的，所述克隆质粒P-I.suis-18S采用以下方法制备得到：全基因合成猪等孢球虫18SrRNA基因片段，猪等孢球虫18SrRNA基因片段酶切后与与pUC57载体连接，筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为P-I.suis-18S。在本专利技术中，优选的，使用该实时荧光PCR试剂盒用于检测仔猪脐带血中猪等孢球虫时，反应体系以20μL计为：荧光PCR反应液(含酶)：15μL；10μMSEQIDNO:1所示的上游扩增引物：0.4～0.8μL，10μMSEQIDNO:2所示的下游扩增引物：0.4～0.8μL，10μMSEQIDNO:3所示的特异性荧光探针：0.4μL～0.8μL；DNA模板：2μL；ddH2O：补足至20μL。在本专利技术中，优选的，使用该实时荧光PCR试剂盒用于检测仔猪脐带血中猪等孢球虫时，实时荧光PCR的反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃延伸30s，共40个循环。在本专利技术中，实时荧光PCR结果分析：在阴性对照检测无Ct值，阳性对照检测Ct值≤30时，则结果判定成立。结果分析：检测样品有典型的扩增曲线，且Ct值≤35，则判断样品为猪等孢球虫感染阳性；若检测样品35<Ct值≤40，表明病毒载量低，标注可疑，并进行重复检测，若重复检测结果仍为35<Ct值≤40，则本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测仔猪脐带血中猪等孢球虫的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：上游扩增引物：5’‑ATAGTAACCGAACGGATCGC‑3’，其为SEQ ID NO:1序列；下游扩增引物：5’‑CGTCGAAAGCTGATAGGTCA‑3’，其为SEQ ID NO:2序列；特异性荧光探针：FAM‑5’‑TTGAATGATCCATCGCCGGC‑3’‑TAMARA，其为SEQ ID NO:3序列，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因。
【技术特征摘要】
1.一种检测仔猪脐带血中猪等孢球虫的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括扩增引物和特异性荧光探针，所述扩增引物和特异性荧光探针的序列如下所示：上游扩增引物：5’-ATAGTAACCGAACGGATCGC-3’，其为SEQIDNO:1序列；下游扩增引物：5’-CGTCGAAAGCTGATAGGTCA-3’，其为SEQIDNO:2序列；特异性荧光探针：FAM-5’-TTGAATGATCCATCGCCGGC-3’-TAMARA，其为SEQIDNO:3序列，其中FAM为荧光报告基因，TAMARA为荧光淬灭基因。2.根据权利要求1所述的检测仔猪脐带血中猪等孢球虫的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针的摩尔比为1:1:1。3.根据权利要求2所述的检测仔猪脐带血中猪等孢球虫的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述上游扩增引物、所述下游扩增引物和所述特异性荧光探针在所述试剂盒中的终浓度均为0.2～0.4μM。4.根据权利要求1所述的检测仔猪脐带血中猪等孢球虫的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、荧光PCR反应液(含酶)及说明书。5.根据权利要求4所述的检测仔猪脐带血中猪等孢球虫的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O，所述阳性对照为含有猪等孢球虫18SrRNA基因序列的克隆质粒P-I.suis-18S，克隆质粒P-I.suis-18S的终浓度为1×105copies/μ...
【专利技术属性】
技术研发人员：喻正军，李增强，石建，廖娟红，
申请(专利权)人：湖南新南方养殖服务有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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