本发明专利技术公开了一种ROS1融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒，包括：用于检测ROS1融合基因变体的正向引物、共用反向引物和荧光探针；所述正向引物为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.10所示的十种单链DNA中的至少一种；所述共用反向引物为SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.13所示的三种单链DNA中的至少一种；所述荧光探针为SEQ ID NO.14至SEQ ID NO.16所示的三种单链DNA中的至少一种。本发明专利技术还公开了ROS1融合基因变体的检测方法。本发明专利技术针对ROS1融合基因变体设计了特异性引物和荧光探针，提高了对ROS1融合基因变体检测的敏感性和特异性，假阳性低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种ROS1融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒，属于分子生物学检测
技术介绍
肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC包括鳞癌、腺癌、腺鳞癌、大细胞癌、类癌等，NSCLC占所有肺癌病例的80-90％，每年新发肺癌病例约为150万，严重威胁人类健康。NSCLC的治疗包括手术、化疗、放疗、分子靶向治疗及生物免疫治疗等多种方法。手术治疗是NSCLC最佳治疗方法，但当NSCLC发现时，仅20-30％的病例有手术指征，且术后复发和转移率仍高达50％以上。分子靶向治疗以其符合生理、低毒和理论上高效的特点，越来越成为非小细胞肺癌治疗的热点。靶向治疗为肺癌的治疗增添了一个新的领域，也为肺癌的个体化治疗带来了新的希望。未来肺腺癌的个体化治疗的趋势是先确定基因突变相关的分子分型。肺腺癌常见的基因变异有表皮生长因子受体(EGFR)、Kirsten鼠肉瘤病毒基因(K-ras)、原癌基因人类表皮生长因子受体2(HER2)、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(BRAF)基因突变，棘皮动物微管相关类蛋白4(EML4)与间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合基因EML4-ALK、驱动蛋白家5B基因(KIF5B)与酪氨酸激酶受体(RET)融合基因KIF5B-RET，EGFR突变与EML4-ALK融合并存以及新发现的活性氧基团基因1(ROS1)的重排。不同的基因变异型患者存在不同的治疗靶点，临床治疗及疗效亦存在明显的个体差异性。就目前的研究而言，20％～30％的NSCLC患者存在ROSl的高表达，作为最新发现的肺癌驱动基因，对临床实践具有非常重要的指导意义。ROSl融合基因的发现及其抑制剂临床活性的证实，进一步推动了晚期NSCLC个体化治疗的发展。目前对于女性不吸烟的亚裔NSCLC患者而言，通过分子标志物检测，94％的患者可获知其肿瘤驱动基因的表达。而在不远的将来，随着这些不同的分子标志物检测手段的成熟，我们必将迎来NSCLC个体化治疗的全新突破。活性氧基团基因1(reactiveoxygenspecies1，ROS1)是胰岛素受体家族的一种跨膜酪氨酸激酶，与禽流感肉瘤病毒UR2的v-ros序列具有同源性，因此被命名为ROS基因，之前也称为c-ros-1、mcf3基因。ROS1基因位于6q22染色体，含7368bp和43外显子，ROS1基因由一个酪氨酸激酶区域、一个跨膜区域和一个含N端糖基化位点的细胞外区域组成，编码具有酪氨酸激酶活性的Ⅰ型完整膜蛋白，其配体未知。ROS1基因发生重排时丢失细胞外区域，保留跨膜和细胞内酪氨酸激酶区域，重排位点主要发生在ROS1基因的32-36外显子。在NSCLC中ROS1基因主要与SLC34A2、CD74发生融合，CD74-ROSl融合：染色体5q32和6q22的易位导致了ROSl基因的大部分细胞外结构域编码区被CD74替代，CD74的6号外显子与ROSl的34号或是32号外显子结合形成新的CD74-ROSl融合基因，导致了跨膜受体CD74的N末端与ROSl结合形成融合蛋白；SLC34A2-ROSl融合：SLC34A2-ROSl融合基因在HCC78细胞株中首次被发现，SLC34A2和ROSl的结合位点与CD74-ROSl相似，ROSl的细胞外结构域被SLC34A2替代，并且同样保留了ROSl细胞内的酪氨酸激酶结构域。目前，可能导致肿瘤生长的基因组学改变包括基因突变、基因扩增、基因易位和基因序列内部串联，现今发现的ROSl融合基因融合类型主要有以下十种：Variant1(TPM3exon10/ROS1exon35)、Variant2(SDC4exon2/ROS1exon32)、Variant3(SDC4exon4/ROS1exon32)、Variant4(SDC4exon4/ROS1exon34)、Variant5(SLC34A2exon13/ROS1exon32,aninsertionatthepositionofnucleotide568ofSLC34A2exon13)、Variant6(CD74exon6/ROS1exon32)、Variant7(CD74exon6/ROS1exon34)、Variant8(EZRexon10/ROSexon34)、Variant9(LRIG3exon17/ROS1exon35)、Variant10(GOPCexon7/ROS1exon35)。注：“Variant”代表融合基因变体；“exon”代表外显子。目前，ROS1融合基因的常用方法主要是荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybrid-ization，FISH)、免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)、逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerisechainreaction，RT-PCR)。FISH已获美国食品与药品管理局(FDA)批准用于在NSCLC患者中检测ALK重排。FISH在检测未知融合型方面的优势是其他两种方法所不能及的，且特异性很高，但也存在检测成本高、检测结果难以判读、主观性强等劣势。IHC的检测成本较低，大部分医院的病理科都可以开展。但IHC检测取决于ROSl融合蛋白的表达量和相应抗体的特异性与敏感性，在未发现理想的抗体之前，IHC检测的准确性和重复性尚难保证。RT-PCR具有可以明确融合型、所需组织量极少等优点，但不能检测新的未知的融合型，在当前ROSl的融合型并未全部揭晓之前，使用其筛查ROSl融合可能遗漏未知的融合型，而且其对组织中RNA的质量有较高要求，若组织中的RNA降解严重，则可能影响最终的检测结果。扩增阻碍突变系统(AmplificationRefractoryMutationSystem,ARMS)也称为等位基因特异性扩增法(Allele-specificamplification,ASA)或等位基因特性PCR(allele-specificPCR，ASPCR)，于1989年建立，是PCR技术应用的发展，用于对已知突变基因进行检测。ARMS的基本原理是PCR扩增时引物是否能延伸主要取决于引物3′端的1～2个碱基是否与模板配对，如果不配对则引物不能延伸，故只要能设计适当的引物，就可以区别正常和突变的DNA序列。该法首先设计两个5′端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3′端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完全互补的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ROS1融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒，其特征在于，包括：用于检测ROS1融合基因变体的正向引物、共用反向引物和荧光探针；所述正向引物为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.10所示的十种单链DNA中的至少一种；所述共用反向引物为SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.13所示的三种单链DNA中的至少一种；所述荧光探针为SEQ ID NO.14至SEQ ID NO.16所示的三种单链DNA中的至少一种。
【技术特征摘要】
1.一种ROS1融合基因ARMS荧光定量PCR分型检测试剂盒，其特征在于，包括：用
于检测ROS1融合基因变体的正向引物、共用反向引物和荧光探针；
所述正向引物为SEQIDNO.1至SEQIDNO.10所示的十种单链DNA中的至少一种；所
述共用反向引物为SEQIDNO.11至SEQIDNO.13所示的三种单链DNA中的至少一种；所
述荧光探针为SEQIDNO.14至SEQIDNO.16所示的三种单链DNA中的至少一种。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针的5′端标记有FAM荧光报
告基团，3’端标记MGB荧光淬灭基团。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，包括：用于检测ROS1
融合基因变体Variant1、Variant9和Variant10的正向引物、共用反向引物和荧光探针，其正
向引物序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示；共用反向引物序列如
SEQIDNO.11所示；荧光探针序列如SEQIDNO.14所示；
用于检测ROS1融合基因变体Variant2、Variant3、Variant5和Variant6的正向引物、共
用反向引物和荧光探针，其正向引物序列分别如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6
和SEQIDNO.7所示；共用反向引物序列如SEQIDNO.12所示；荧光探针序列如SEQID
NO.15所示；
用于检测ROS1融合基因变体Variant4、Variant7和Variant8的正向引物、共用反向引物
和荧光探针，其正向引物序列分别如SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示；共
用反向引物序列如SEQIDNO.13所示；荧光探针序列如SEQIDNO.16所示。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中，还包括如下物质中的至少一
种：阳性对照和荧光定量反应液预混液。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为分别包含ROS1融合基因
变体Variant1、Variant2、Variant3、Variant4、Variant5、Variant6、Variant7、Variant8、Va...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟明，李香梅，
申请(专利权)人：安徽达健医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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