本发明专利技术提供一种宫颈癌早期筛查检测试剂盒及其应用，通过采用亚硫酸氢盐修饰法对待测宫颈癌核酸样品进行亚硫酸氢盐转化，结合荧光定量PCR技术，综合分析文献研究结果、TCGA甲基化芯片数据库以及转录组测序表达谱，通过多重数据过滤分析，筛选宫颈癌高甲基化候选基因，针对宫颈癌高甲基化候选基因上的多个甲基化检测位点设计特异性的基因甲基化检测引物和探针，覆盖10个以上甲基化CpG位点，通过多重PCR扩增技术扩增经亚硫酸氢盐修饰的待测DNA样品，根据PCR扩增结果来确定待测样品中目标基因的甲基化情况，通过多种途径提高试剂盒的灵敏度与特异性，实现宫颈癌的早期筛查与诊断。断。断。
【技术实现步骤摘要】
一种宫颈癌早期筛查检测试剂盒及其应用
[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种组合物及其在疾病检测中的用途，具体地涉及一种宫颈癌早期筛查检测试剂盒及其应用。
技术介绍
[0002]宫颈癌(cervical cancer)是女性最常见的生殖系统恶性肿瘤之一，在全球女性恶性肿瘤中居第二位，其发病率和死亡率仅次于乳腺癌，严重威胁女性身心健康。宫颈癌的发生几乎都是与高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染相关，发病年龄以40至50岁为最多，近年来发病有年轻化趋势。宫颈癌发生在子宫颈部位，多数为鳞癌，其次为腺癌、腺鳞癌，少见类型有小细胞癌、透明细胞癌等。宫颈癌早期一般没有任何症状，随着疾病的进展，才出现接触性出血、异常阴道流血等症状，需要主动筛查才会被发现。宫颈癌治疗效果与临床分期密切相关，早期癌宫颈癌通常有较好的预后，尽早发现宫颈癌可增加手术保留子宫的机会，提高总体生存率，早诊早治是提高治愈率的关键，同时宫颈癌有复发的可能性，因此预后监控亦要引起重视，如何尽早发现宫颈癌以及术后如何及时检测到宫颈癌的复发具有非常重要的临床意义。
[0003]目前宫颈癌的诊断技术有：1)宫颈刮片细胞学检查：易受到主观因素影响，有一定的假阴性率，容易漏诊；2)影像学技术：MRI检查、B超检查、CT检查，但对较小的肿瘤不够灵敏，无法进行明确诊断；3)阴道镜检查：肉眼并不能观察出是否癌变，对有阴道狭窄、宫颈表面坏死、出血的患者亦不适用；4)宫颈活体组织检查：该方法属于有创性检查，操作较复杂，对需要长期跟踪观察的患者，会造成身体不适，且经济负担较重。因此有必要开发一种无创的可靠的新型宫颈癌标识物和检测技术，提高宫颈癌早癌检出率，改善宫颈癌治疗效果，降低宫颈癌死亡率。
[0004]随着分子生物学技术的发展，表观遗传学在近年来肿瘤研究上越来越受到重视，DNA的甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA调控等表观遗传学改变都被认为与肿瘤的发生有着密切关系，其中DNA的甲基化是最为常见的表观遗传学改变，其可调控细胞增殖、凋亡与分化，且水平与肿瘤的生物学特性密切相关。目前研究表明宫颈癌患者特定基因的DNA甲基化改变(包括高甲基化和低甲基化)与已被证实的肿瘤特征有关，包括持续性增生信号的采集，抗细胞死亡，生长抑制的逃避，无限增生，炎症反应，能量代谢失调，诱导血管生成以及浸润激活。DNA甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变，因此DNA甲基化指标的检测可以作为癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标。
[0005]针对DNA甲基化检测方法大致可分为两类：全基因组甲基化分析和特异位点甲基化检测。全基因组甲基化分析检测成本较高，常作为一种高通量的筛选发现目标基因的手段；特异位点甲基化检测方法有联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化特异性PCR法(MSP)、甲基化荧光定量法(MethyLight)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法等，限制性内切酶分析法只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，甲基化特异性PCR法基于
NO.27所示的下游引物、如SEQ ID NO.28所示的荧光探针。
[0013]在本专利技术一实施例中，所述的宫颈癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，还包括括检测内参基因GAPDH的PCR引物及探针，所述引物包括如SEQ ID NO.29所示的上游引物、如SEQ ID NO.30所示的下游引物，所述探针包括如SEQ ID NO.31所示的荧光探针。
[0014]在本专利技术一实施例中，所述荧光探针的5
’
端包含有荧光报告基团，包括FAM、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5中的任意一种。
[0015]在本专利技术一实施例中，所述荧光探针的3
’
端包含有荧光淬灭基团，包括MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3中的任意一种。
[0016]在本专利技术一优选实施例中，所述荧光淬灭基团为MGB。
[0017]本专利技术第三方面提供宫颈癌早期筛查检测试剂盒，所述试剂盒包括如本专利技术第二方面所述的PCR引物探针组合，还包括阳性质控品以及阴性质控品。
[0018]在本专利技术一实施例中，所述阳性质控品为宫颈癌组织DNA。
[0019]在本专利技术一实施例中，所述阴性质控品为白细胞DNA。
[0020]在本专利技术一实施例中，所述宫颈癌早期筛查检测试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.1-1μM PCR引物、0.1-1μM探针。
[0021]在本专利技术一优选实施例中，所述宫颈癌早期筛查检测试剂盒反应体系的终浓度组成包括：0.1-0.5μM PCR引物、0.1-0.5μM探针。
[0022]在本专利技术一实施例中，所述宫颈癌早期筛查检测试剂盒的荧光定量PCR反应条件如下：
[0023]在本专利技术一实施例中，所述宫颈癌早期筛查检测试剂盒的荧光定量PCR反应条件如下：如下：
[0024]本专利技术第四方面提供宫颈癌基因甲基化检测的检测方法，包括以下步骤：
[0025]1)分离待测生物样品中目标基因的核酸；
[0026]2)将步骤1)所得核酸经亚硫酸氢盐转化处理，得到亚硫酸氢盐转化的DNA(Bis-DNA)；
[0027]3)采用甲基化荧光定量PCR技术检测步骤2)所得Bis-DNA的甲基化状态。
[0028]在本专利技术一实施例中，步骤1)所述生物样品包括组织、细胞中的一种。
[0029]在本专利技术一优选实施例中，步骤1)所述生物样品包括宫颈脱落细胞。
[0030]本专利技术第五方面提供如本专利技术第一方面所述的宫颈癌基因甲基化检测位点、如本专利技术第二方面所述的宫颈癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合、如本专利技术第三方面所述的宫颈癌早期筛查检测试剂盒或如本专利技术第四方面所述的宫颈癌基因甲基化检测的检测方法在制备检测宫颈癌试剂盒中的应用。
[0031]本专利技术有益效果如下：
[0032]1)可作为宫颈癌的早期筛查、进程监测、预后评估的重要指标：本专利技术提供的宫颈癌早期筛查检测试剂盒以DNA甲基化异常作为检测对象，DNA甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变，因此DNA甲基化指标的检测可以作为宫颈癌的早期筛查、进程监测、预后评估的重要生物指标；
[0033]2)无创检测：本专利技术提供的宫颈癌早期筛查检测试剂盒可通过检测宫颈脱落细胞中宫颈癌相关基因甲基化状态来辅助诊断宫颈癌，实现无创检测；
[0034]3)单管多重基因甲基化检测：建立单管多重基因甲基化检测位点联检，减少试剂消耗，降低耗材成本，同时减少实验人员的操作步骤，减少劳动成本。
[0035]4)准确性高：本专利技术提供的宫颈癌早期筛查检测试剂盒通过多重数据分析筛选宫颈癌高甲基化候选基因，针对宫颈癌高甲基化候选基因上的多个甲基化检测位点设计特异性的基因甲基化检测引本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.宫颈癌基因甲基化检测位点，其特征在于，所述的基因甲基化检测位点包括PAX1、MAGI2、SOX17中的一种或多种。2.宫颈癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，包括以下1)-3)所示的核酸序列组合中的一种或或多种：1)PAX1甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合1、引物探针组合2、引物探针组合3中的一种或多种，其中所述引物探针组合1包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物、如SEQ ID NO.2所示的下游引物、如SEQ ID NO.3所示的荧光探针，所述引物探针组合2包括如SEQ ID NO.4所示的上游引物、如SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.6所示的下游引物、如SEQ ID NO.7所示的荧光探针，所述引物探针组合3包括如SEQ ID NO.8所示的上游引物、如SEQ ID NO.9所示的下游引物、如SEQ ID NO.10所示的荧光探针；2)MAGI2甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合4、引物探针组合5、引物探针组合6中的一种或多种，其中所述引物探针组合4包括如SEQ ID NO.11所示的上游引物、如SEQ ID NO.12所示的下游引物、如SEQ ID NO.13所示的荧光探针，所述引物探针组合5包括如SEQ ID NO.14所示的上游引物、如SEQ ID NO.15所示的下游引物、如SEQ ID NO.16所示的荧光探针，所述引物探针组合6包括如SEQ ID NO.17所示的上游引物、如SEQ ID NO.18所示的下游引物、如SEQ ID NO.19所示的荧光探针；3)SOX17甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合7、引物探针组合8、引物探针组合9中的一种或多种，其中所述引物探针组合7包括如SEQ ID NO.20所示的上游引物、如SEQ ID NO.21所示的下游引物、如SEQ ID NO.22所示的荧光探针，所述引物探针组合8包括如SEQ ID NO.23所示的上游引物、如SEQ ID NO.24所示的下游引物、如SEQ ID NO.25所示的荧光探针，所述引物探针组合9包括如SEQ ID N...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵琦，
申请(专利权)人：安徽达健医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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