用于食管癌基因甲基化检测的试剂及其试剂盒与应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了用于食管癌基因甲基化检测的试剂及其试剂盒与应用，具体公开了用于食管癌基因甲基化检测的检测区域。本发明专利技术提供的食管癌基因甲基化检测的检测区域，可用于食管癌的早期筛查、进程监测、预后评估的重要检测指标，以DNA甲基化异常作为检测对象，DNA甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变，因此DNA甲基化区域的检测可以作为食管癌的早期筛查、进程监测、预后评估的重要生物指标。要生物指标。

【技术实现步骤摘要】
用于食管癌基因甲基化检测的试剂及其试剂盒与应用


[0001]本专利技术属生物
，具体涉及用于食管癌基因甲基化检测的试剂及其试剂盒与应用。

技术介绍

[0002]食管癌是指从下咽食管起始部到食管胃结合部之间食管上皮来源的癌，主要分为食管鳞状细胞癌、食管腺癌和未分化癌(较少见，恶性程度高)，是最常见的十大恶性肿瘤之一。食管癌早期患者的手术切除率达100％，手术死亡率在2.5％以下，术后5年生存率达92.6％；食管癌的早期症状不明显，若出现进行性吞咽困难，进食后梗噎感、烧灼感、停滞感或饱胀感等症状时，一般属于中晚期阶段而食管癌中晚期患者的术后5年生存率仅30％上下。现阶段食管癌的辅助检查手段主要包括影像学检查(CT、上消化道造影、MRI、PET
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CT、超声检查等)、内窥镜检查、肿瘤标志物检查等技术，这些检查技术或检测成本高；或侵入性强；或灵敏度低，不适用于作为食管癌患者早筛的手段。因此迫切需要寻找早期食管癌的生物标志物，开发出灵敏、特异、快捷的检测技术和检测方法，提高食管癌的早期检测率，让更多的食管癌患者在癌症早期发现，给予及时的干预治疗，降低食管癌患者的死亡率。
[0003]DNA甲基化可调控细胞增殖、凋亡与分化，是最早被发现、也是研究最深入的表观遗传调控机制之一。DNA甲基化异常与肿瘤的发生是否存在必然性一直是医学界研究的热点之一。目前发现的哺乳动物DNA甲基化的唯一形式就是发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程。大多数人类肿瘤组织中都发现有基因甲基化异常，癌细胞中表观遗传编码出现的紊乱也会率先表现在DNA甲基化水平紊乱，且大多数的异常甲基化为抑癌基因的高甲基化，抑癌基因CpG岛的局部高度甲基化往往会导致抑癌基因的转录沉默，会早于癌细胞的恶性增殖，并贯穿癌症的整个发展过程。食管癌的癌变过程是一个多基因变异累积的复杂过程，涉及到多种癌基因和抑癌基因的异常甲基化，因此DNA甲基化指标的检测可以用于肿瘤的早期筛查、诊断、分级以及抗癌药物治疗阶段和预后的疗效监测。
[0004]目前DNA甲基化用于肿瘤检测的方法主要分为全基因组甲基化分析和特异位点甲基化检测两大类。全基因组甲基化分析因其检测成本高，经常作为一种高通量筛选发现目标基因的手段。特异位点甲基化检测方法又可以细分为联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化特异性PCR法(MSP)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法、甲基化荧光定量法(MethyLight)等。限制性内切酶分析法只能针对已获得特殊酶切位点的甲基化情况，适用范围小；甲基化特异性PCR法基于普通PCR及电泳分析操作繁琐，容易造成样本污染；甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法需要使用带高分辨率熔解(HRM)模块的荧光定量PCR仪进行检测，对仪器设备要求较高；甲基化荧光定量法基于其较高的通量和敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了样本污染和操作误差，在DNA甲基化的检测中应用较为广泛。但甲基化荧光定量法使用荧光定量PCR时，需要依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，容易产生批内和批间的误差；且对低浓度核酸样本检测的灵敏度不足，容易造成假阴性延误患者病情。与荧光定量PCR相比，数字PCR通过对核酸分子的绝对定量计数，具有更
高的检测灵敏度和准确度。数字PCR是将核酸样本进行稀释，遵循泊松分布规律，在微反应单元内高效灵敏地完成目标核酸片段的PCR扩增，获取荧光信号，直接给出靶序列的拷贝数，进行统计学分析，实现了对起始样本的绝对定量，降低了实验结果在批内和批间的误差，提高了检测的灵敏度，可以有效减少假阴性的发生。
[0005]基于现有技术所存在的不足，本专利技术通过筛选食管癌的相关甲基化基因，建立基于数字PCR的食管癌基因甲基化检测方法，期望获取具有更高灵敏度、特异性和准确性的检测试剂，实现对食管癌患者的早期筛查、诊断、分级以及抗癌药物治疗阶段和预后的疗效监测。

技术实现思路

[0006]本专利技术第一方面的目的，在于提供用于食管癌基因甲基化检测的检测区域。
[0007]本专利技术第二方面的目的，在于提供用于食管癌基因甲基化检测的标志物组合。
[0008]本专利技术第三方面的目的，在于提供一种试剂。
[0009]本专利技术第四方面的目的，在于提供一种试剂盒。
[0010]本专利技术第五方面的目的，在于提供用于食管癌基因甲基化检测的非疾病诊断目的的检测方法。
[0011]本专利技术第六方面的目的，在于提供本专利技术第一方面的用于食管癌基因甲基化检测区域、本专利技术第二方面的DNA甲基化标志物组合、本专利技术第三方面的试剂或本专利技术第四方面的试剂盒在食管癌诊断和/或辅助诊断的产品中的应用。
[0012]为了实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
[0013]本专利技术的第一个方面，提供用于食管癌基因甲基化检测区域，包括(a1)和/或(a2)所示的基因甲基化检测区域；
[0014](a1)IRF4基因甲基化检测区域，包括Chr6:391499
‑
391683经亚硫酸盐转化后所得的甲基化检测区域，所述Chr6:391499
‑
391683的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
[0015](a2)UNC5D基因甲基化检测区域，包括Chr8:35235143
‑
35235452经亚硫酸盐转化后所得的甲基化检测区域，所述Chr8:35235143
‑
35235452的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。
[0016]优选地，(a1)中所述的IRF4基因甲基化检测区域，包括Chr 6:391506
‑
391630和/或Chr6:391531
‑
391683，所述Chr 6:391506
‑
391630核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述Chr6:391531
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391683的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。
[0017]优选地，(b1)中所述的UNC5D基因甲基化检测区域，包括Chr8:35235311
‑
35235452和/或Chr8:35235310
‑
35235426，所述Chr8:35235311
‑
35235452的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，所述Chr8:35235310
‑
35235426的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。
[0018]本专利技术的第二个方面，提供一种用于食管癌检测的DNA甲基化标志物组合，所述标志物组合包含SEQ ID NO.22和/或SEQID NO.23序列中的CpG岛区域。
[0019]本专利技术的第三个方面，提供一种试剂，包括能够特异性检测生物样本中(b1)
‑
(b3)中至少任一目标核苷酸序列中CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂；
[0020](b1)SEQ ID NO.2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于食管癌基因甲基化检测的检测区域，其特征在于，包括(a1)和/或(a2)所示的检测区域；(a1)IRF4基因甲基化检测区域，包括Chr6:391499
‑
391683经亚硫酸盐转化后所得的检测区域，所述Chr6:391499
‑
391683的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；(a2)UNC5D基因甲基化检测区域，包括Chr8:35235143
‑
35235452经亚硫酸盐转化后所得的检测区域，所述Chr8:35235143
‑
35235452的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。2.用于食管癌基因甲基化检测的标志物组合，其特征在于，所述标志物组合包含SEQ ID NO.22和/或SEQ ID NO.23序列中的CpG岛区域。3.一种试剂，其特征在于，包括能够特异性检测生物样本中(b1)
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(b3)中至少任一目标核苷酸序列中CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂；(b1)SEQ ID NO.22和/或SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列的全长或其任意部分区域；(b2)与SEQ ID NO.22和/或SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列互补序列的全长或其任意部分区域；(b3)与(b1)或(b2)至少90％以上同一性的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括核酸分子；优选地，所述核酸分子包括可扩增所述(b1)、(b2)和/或(b3)所示核苷酸序列的引物对；优选地，所述核酸分子还包括可标记所述(b1)、(b2)和/或(b3)所示核苷酸序列的探针；优选地，所述探针的序列两端标记有修饰基团。5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述引物对包括(c1)
‑
(c4)中的一种或多种；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红乐，李俊，徐斌杰，李香梅，周长悦，陈颖琪，
申请(专利权)人：安徽达健医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：