利用肠道菌区分晚期突变型和野生型非小细胞肺癌的方法技术

利用肠道菌区分晚期突变型和野生型非小细胞肺癌的方法，包括如下步骤，步骤A：对EGFR突变型和EGFR野生型肺癌患者的粪便进行采集，步骤B：分别提取粪便样品中的总DNA，并对提取的DNA测定其浓度和纯度；步骤C：对步骤B获得的样品进行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化、洗脱，然后进行浓度测定，之后组成一个测序文库；步骤D：对检测合格的文库进行测序；步骤E：采用差异表达分析，获得EGFR突变型和EGFR野生型肺癌患者的差异微生物类别数据。本发明专利技术通过无创、价格等优势作为不同分子分型患者的初筛选，能作为肿瘤基因检测技术的补充手段，解决了现有技术获取患者的肿瘤组织、体液获取会给患者带来创伤，以及基因检测价格昂贵等缺点。以及基因检测价格昂贵等缺点。以及基因检测价格昂贵等缺点。

【技术实现步骤摘要】
利用肠道菌区分晚期突变型和野生型非小细胞肺癌的方法


[0001]本专利技术涉及医疗
，特别是一种利用肠道菌区分晚期突变型和野生型非小细胞肺癌的方法。

技术介绍

[0002]肺癌是全球发病率、死亡率的最高的癌种之一，其中突变型非小细胞肺癌(NSCLC)大约占据80％，2021年美国男性及女性肺癌死亡人数均占总癌症死亡人数的22％，高居第一，且确诊时超过50％患者已出现远处转移，5年生存率小于20％。随着精准医学时代的到来及个体化治疗的发展，通过基因检测确定分子分型是晚期NSCLC患者诊疗的重要理念，其中表皮生长因子受体(EGFR)基因是分子分型中最常见、最重要的基因，目前技术，主要根据分子分型，结合社会经济等因素，采取化疗、靶向治疗或免疫治疗等全身治疗方法。近年来，以表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKI)为代表的靶向治疗和以免疫检查点抑制剂(ICI)为代表的免疫治疗为晚期突变型和野生型NSCLC带来极大的生存获益，故通过基因检测明确分子分型极为重要。在临床实践中，可通过组织、体液等行基因检测，目前，现有对于肺癌患者的样本获取，一方面是通过纤维支气管镜、超声支气管镜、肺组织穿刺活检等技术方法获取肿瘤组织行基因检测，虽然经肿瘤组织行基因检测最为精准，但相应技术为有创操作，存在引起患者不适感或者加重疾病风险可能，并且存在获取肿瘤组织少影响后续检测工作的问题，且肿瘤组织基因检测还存在价格昂贵等缺点。另一方面，通过胸腔穿刺、腹腔穿刺、腰椎穿刺、静脉采血等技术获取相应体液行肿瘤基因检测，体液基因检测可作为肿瘤基因检测补充，但也存在技术有创，基因检测价格昂贵等缺点。
[0003]人体胃肠道拥有丰富和多样化的微生物种群。肠道微生物群由10
13
至10
14
个微生物组成，它们的基因组总和至少是人类基因组的100倍。肠道菌群在人体肠道中有多种基本功能，如将大分子营养物质发酵成小分子物质、合成维生素、代谢环境来源有毒化合物、抵御病原体、加强肠道屏障、调节免疫系统等。肠道微生物群与宿主存在共生关系，在宿主的营养，免疫和新陈代谢中起着一定作用。当肠道菌群失调，会导致许多疾病发生，如肥胖症、炎症性肠病、2型糖尿病、阿尔兹海默病、癌症等。肠道微生态失调与肺癌发生、发展有着密切相关的联系。相比于健康人群，肺癌患者一般存在肠道微生态失调现象，有研究揭示了肺癌患者肠道菌群的特征，与健康人群相比，肺癌人群拟杆菌门、梭菌门、蓝藻门、螺旋体门和黏胶球形菌门，拟杆菌属、韦荣球菌属和梭杆菌属的丰度显著升高，而厚壁菌门和疣微菌门，志贺氏杆菌属、克吕沃尔氏菌属、普氏杆菌属、肠杆菌属、小杆菌属的丰度显著降低。研究表明，肺腺癌患者中富集巨球型菌属和Erysipelatoclostridium菌属，而肺鳞癌中优势菌为肠球菌属、韦荣球菌属和Eubacterium_eligens_group菌属。由于肺癌患者与健康患者肠道菌群结构有所不同，不同病理类型的肺癌也有期独特的肠道菌群组成，肠道菌群与肺癌有着密切关系，因此可利用病人肠道菌群类型，区分不同分子分型肺癌，借助其无创、方便以及价格优势有望成为肺癌精准治疗时代的重要补充技术手段。目前国内外还没有通过肠道菌群区分EGFR突变型和EGFR野生型肺癌患者的技术。

技术实现思路

[0004]为了克服现有肿瘤患者组织或者体液基因检测技术存在的有创、价格昂贵等缺点，本专利技术提供了一种通过16S rRNA测序等，阐明EGFR突变型和野生型非小细胞肺癌患者肠道菌群差异，通过动物实验证明差异肠道菌群影响不同分子分型非小细胞肺癌发生发展，从而将差异菌群作为生物标记物，作为无创诊断技术区分EGFR突变型和野生型非小细胞肺癌，为有效治疗肺癌起到了有利技术支持的用肠道菌区分晚期突变型和野生型非小细胞肺癌的方法。
[0005]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0006]利用肠道菌区分晚期突变型和野生型非小细胞肺癌的方法，其特征在于包括如下步骤，步骤A：对EGFR突变型和EGFR野生型肺癌患者的粪便进行采集，具体操作中，经PC机内的统计软件单元先登记入组患者的各种临床信息，并收集患者未使用任何抗肿瘤药物时的粪便，各留取0.25g
‑
1.0g粪便至含有EffcGut保护液的取样管内备用；步骤B：对各取样管内的0.25g粪便样品，分别提取粪便样品中的总DNA，并对提取的DNA测定其浓度和纯度、检测DNA的完整性，检测合格的DNA用于下一步骤；步骤C：步骤B获得的样品，各采用两端都加有不同Index的引物对，各对EGFR突变型和EGFR野生型肺癌患者样品细菌中的16S rRNA基因的V4区进行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化、洗脱，然后进行浓度测定，之后取等量的每个样品混合在一起，组成一个测序文库；步骤D：对步骤C获得的测序文库，分别对文库的插入片段和文库的摩尔浓度进行检测和精确定量，然后对检测合格的文库进行测序；步骤E：对步骤D获得的测序后文库数据进行拼接和质控得到高质量的Clean reads，再进行嵌合体过滤，采用QIIME软件进行OTU聚类，然后采用差异表达分析，获得EGFR突变型和EGFR野生型肺癌患者的差异微生物类别数据。
[0007]进一步地，所述步骤B中，提取的DNA经过Multiskan
TM
GO全波长酶标仪测定其浓度和纯度，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。
[0008]进一步地，所述步骤D中，使用Qubit 3.0荧光定量仪进行浓度测定，使用QSEP100和ABI7300荧光定量PCR仪分别对文库的插入片段和文库的摩尔浓度进行检测及精确定量。
[0009]进一步地，所述步骤D中，检测合格的文库采用Illumina的MiniSeq平台进行Paired
‑
End 150测序。
[0010]进一步地，所述步骤E中，具体采用Flash软件进行拼接和质控。
[0011]本专利技术有益效果是：本专利技术经相关流程，能通过粪便内的肠道菌群区分两种不同分子分型NSCLC患者，一方面，粪便标本获取简单并且无创；另一方面，16S rRNA测序价格低廉，有利于不同分型患者的初筛选，通过无创、价格等优势作为不同分子分型患者的初筛选，能作为肿瘤基因检测技术的补充手段。本专利技术解决了现有技术获取患者的肿瘤组织、体液获取会给患者带来创伤，以及基因检测价格昂贵等缺点。综上，本专利技术具有好的应用前景。
附图说明
[0012]图1 EGFR突变型和野生型NSCLC肠道菌群a多样性差异示意图。
[0013]图2 EGFR突变型和野生型NSCLC肠道菌群β多样性差异示意图。
[0014]图3 EGFR突变型和野生型NSCLC差异肠道菌群示意图。
具体实施方式
[0015]图1、2、3所示，用肠道菌区分晚期突变型和野生型非小细胞肺癌的方法，包括如下步骤，步骤A：对EGFR突变型和EGFR野生型肺癌患者的粪便进行采集，具体操作中，经PC机内的统计软件单元登记入组患者的临床信息(姓名、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用肠道菌区分晚期突变型和野生型非小细胞肺癌的方法，其特征在于，包括如下步骤，步骤A：对EGFR突变型和EGFR野生型肺癌患者的粪便进行采集，具体操作中，经PC机内的统计软件单元先登记入组患者的各种临床信息，并收集患者未使用任何抗肿瘤药物时的粪便，各留取0.25g
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1.0g粪便至含有EffcGut保护液的取样管内备用；步骤B：对各取样管内的0.25g粪便样品，分别提取粪便样品中的总DNA，并对提取的DNA测定其浓度和纯度、检测DNA的完整性，检测合格的DNA用于下一步骤；步骤C：步骤B获得的样品，各采用两端都加有不同Index的引物对，各对EGFR突变型和EGFR野生型肺癌患者样品细菌中的16S rRNA基因的V4区进行PCR扩增，并对PCR产物进行纯化、洗脱，然后进行浓度测定，之后取等量的每个样品混合在一起，组成一个测序文库；步骤D：对步骤C获得的测序文库，分别对文库的插入片段和文库的摩尔浓度进行检测和精确定量，然后对检测合格的文库进行测序；步骤E：对步骤D获得的测序后文库数据进行拼接和质控得到高质量的Clean reads，再进行嵌...

【专利技术属性】
技术研发人员：周清，
申请(专利权)人：广东省人民医院，
类型：发明
国别省市：