本发明专利技术提供了用于检测肺腺癌的标记物、引物组以及试剂盒。本发明专利技术提供了用于筛查肺腺癌的标记物miR
【技术实现步骤摘要】
ID NO：3所示；所述内参引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
[0011]本专利技术的第三目的是提供上述的引物组在制备检测肺腺癌结节的试剂盒中的应用。
[0012]本专利技术的第四目的是提供上述的引物组在制备检测肺腺癌胸腔积液的试剂盒中的应用。
[0013]本专利技术的第五目的是提供上述的引物组在制备检测肺腺癌术后评估的试剂盒中的应用。
[0014]本专利技术的第六目的是提供一种用于非诊断和治疗目的的检测上述的标记物miR
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3p的方法，所述方法包括以下具体步骤：
[0015]步骤S1，血液样本或胸腔积液样本收集及处理；
[0016]步骤S2，采用trizol法提取总RNA；
[0017]步骤S3，RNA定量及逆转录；
[0018]步骤S4，miR
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3p定量分析，包括定量实时qRT
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PCR反应和数据分析。
[0019]进一步的，所述定量实时qRT
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PCR法以U6为内参。
[0020]进一步的，所述miR
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3p的PCR扩增体系总体积为20μL，包括PCR mix 10μL；引物0.8μL；ddH2O 3μL；已稀释的逆转录产物1μL。
[0021]进一步的，所述定量实时qRT
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PCR的反应程序为预变性1次，95℃保持5min；循环反应40次，95℃保持10sec，60℃保持30sec；融解1次，95℃保持15sec，60℃保持60sec，95℃保持15sec。
[0022]进一步的，所述PCR扩增体系中所述检测引物的终浓度为0.2μM，所述内参引物的终浓度为0.2μM。
[0023]与现有技术比较，本专利技术提供的技术方案带来的有益效果是：
[0024](1)本专利技术提供了用于筛查肺腺癌的miR
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3p荧光定量PCR引物，得到的引物对肺腺癌结节、肺腺癌胸腔积液的检测具有很好的敏感性和特异性。
[0025](2)本专利技术提供了用于筛查肺腺癌的的试剂盒，以便于辅助检测肺腺癌的检测。
[0026](3)本专利技术提供的方法单独使用血清miR
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3p诊断区分良性肺腺癌结节与恶性肺腺癌结节，ROC曲线下面积(AUC)为0.9750；单独使用胸腔积液miR
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3p诊断区分良性肺腺癌结节与恶性肺腺癌结节，ROC曲线下面积(AUC)为0.9375；单独使用血清miR
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3p评估恶性肺结节患者术后临床效果差异显著。本领域技术人员知道，ROC曲线下面积在1.0和0.5之间，在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5
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0.7时有较低准确性，AUC在0.7
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0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。因此，血清miR
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3p可以用于制备肺腺癌结节、及评估术后临床效果的诊断试剂盒，胸腔积液miR
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3p也可以用于制备肺腺癌结节的诊断试剂盒。
附图说明
[0027]图1为本专利技术实施例1中的良性肺腺癌结节与恶性肺腺癌结节对比血清中升高表达的miR
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3p图；
[0028]图2为本专利技术实施例1中的血清miR
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3p单独用于区分良性肺腺癌结节与恶
性肺腺癌结节的ROC曲线；
[0029]图3为本专利技术实施例2中的良性肺腺癌与恶性肺腺癌对比胸腔积液中升高表达的miR
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3p图；
[0030]图4为本专利技术实施例2中的胸腔积液miR
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3p单独用于区分良性肺腺癌结节与恶性肺腺癌结节的ROC曲线；
[0031]图5为本专利技术实施例3中的血清miR
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3p用于评估恶性肺腺癌结节术后临床效果的对比图。
具体实施方式
[0032]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和附图，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0033]实施例1
[0034]本实施例为肺腺癌结节患者的血清中miR
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3p标记物的检测方法，具体包括以下步骤：
[0035]步骤S1、血液样本收集及处理；
[0036]收集肺腺癌结节患者静脉血10mL，待凝血后，4度条件下，5000rpm离心10min，收集上清，之后再离心一次，重新收集上清，收集的上清即为血清样本。10mL静脉血收集血清体积约5mL，置于负20℃冰箱保存。
[0037]本实施例采集的患者血清样本来自于江苏省盐城市第一人民医院。
[0038]步骤S2、采用trizol法提取总RNA；
[0039]取200μL血清；每孔加入0.8μLTrizol(Trizol要预冷，避免降解RNA)，吹打混匀；每个EP管中加入200μL氯仿，剧烈振荡数秒，置于冰上5min，静置到看到明显分层；将EP管放于离心机中，16000g，4℃离心20min后吸取上层清液，一般可提取500μL；异丙醇1:1加入,上下颠倒混匀，置
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20℃冰箱放置过夜。将EP管放于离心机中，16000g，4℃离心20min后轻柔弃上清，加入1ml 75％乙醇。将EP管放于离心机中，16000g，4℃离心20min后轻柔弃上清；将EP管倒置于空气中5min，使其干燥(注意不要过渡干燥沉淀，否则难以溶解)；每个EP管中加入20μL无酶水，使RNA溶解，测量其浓度。
[0040]步骤S3、茎环法逆转录
[0041]根据miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(by stem
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loop)MR101(Vazyme)试剂盒说明书，将RNA逆转录为cDNA，保存在
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80℃，具体操作过程如下：
[0042](1)使用“Nanodrop”机器测定血浆外泌体中的RNA浓度：
[0043]打开取样臂，无尘纸清洁测量基座
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吸取1微升(μL)DEPC水作为空白样品调零，滴本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于检测肺腺癌的标记物，其特征在于，所述标记物为miR
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3p，人源miR
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3p的成熟体核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种用于检测肺腺癌标记物miR
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3p的引物组，其特征在于，所述引物组包括检测引物对和内参引物对，所述检测引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述内参引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。3.如权利要求2所述的引物组在制备检测肺腺癌结节的试剂盒中的应用。4.如权利要求2所述的引物组在制备检测肺腺癌胸腔积液的试剂盒中的应用。5.如权利要求2所述的引物组在制备检测肺腺癌术后评估的试剂盒中的应用。6.一种用于非诊断和治疗目的的检测如权利要求1中所述的标记物miR
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3p的方法，其特征在于，所述方法包括以下...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘忠祥，孙关，孙知晓，
申请(专利权)人：刘忠祥，
类型：发明
国别省市：
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