一种基于OPCML的宫颈病变的分子诊断试剂制造技术

本发明专利技术属于基因检测领域，涉及一种基于OPCML的宫颈病变分子诊断试剂。所述的试剂包括针对单个基因标志物甲基化的检测试剂，用于检测所述标志物经修饰后的序列。本申请的试剂经试验证实，可以高灵敏、高特异地检测和诊断宫颈病变，有极高的临床应用价值。有极高的临床应用价值。有极高的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种基于OPCML的宫颈病变的分子诊断试剂


[0001]本专利技术属于基因检测领域，涉及一种基于OPCML的宫颈病变分子诊断试剂。

技术介绍

[0002]宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在我国女性特有的恶性肿瘤中排第二位，仅次于乳腺癌之后。宫颈癌的发生可通过对癌前病变的检查和处理得以有效控制。目前宫颈癌主要的无创筛查手段是细胞学检查和HPVDNA检测。宫颈细胞学涂片检查是现阶段发现早期宫颈癌及癌前病变[宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasias,CIN)]的初筛手段，特别是对临床体征不明显的早期病变的诊断。有巴氏涂片和宫颈液基细胞学检查法(TCT)两种，目前主要采用后者。宫颈细胞涂片检查作为宫颈癌筛查的优点是特异性高，缺点是敏感性不高，易漏检。因其需要专业的病理科医生在显微镜下阅片，因此通量有一定限制。
[0003]宫颈上皮内瘤变(CIN)属于子宫颈上皮非典型增生，其为一个动态变化的过程，分为1、2、3三级，即低、中和高三种程度。高度CIN是指非典型病变以累及上皮全层但未向基底膜浸润，又称宫颈原位癌。继续发展可向基底膜下浸润，可形成宫颈癌。低度CIN病变是指子宫颈上皮非典型增生仅累及上皮全层的上1/3。CIN1又称低级别鳞状上皮内瘤变(Low
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grade Squamous Intraepithelial Lesion,LSIL)，CIN2/CIN3统称高级别鳞状上皮内瘤变(High
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grade Squamous Intraepithelial Lesion,HSIL)。CIN是一个动态变化的过程，但及时治疗可以逆转，恢复正常。因此，CIN的诊断，对于预防或早期干预宫颈癌具有重要意义。
[0004]对于宫颈腺癌，原位腺癌(ACIS)是确定的前体病变。原则上，这些癌前病变是可逆的，尽管病变越严重，自发消退的机会越低。宫颈癌被认为是可预防的疾病，因为癌前阶段可通过脱落细胞学检测，并在必要时相对容易地治疗，只有轻微的副作用。宫颈筛查旨在早期诊断高级恶变前的(即CIN2/3和原位腺癌)和可治疗的癌性病变，从而降低浸润性宫颈癌症的死亡率。一般医疗实践包括治疗所有具有形态学证实的CIN2、CIN3和原位腺癌的女性，以便预防宫颈癌症的发展。
[0005]HPVDNA检测常用于检测生殖道有无人乳头瘤病毒(HPV)感染，间接评估患宫颈癌或宫颈上皮内瘤变的情况。HPV DNA分型检测有助于鉴别是否有高危型HPV病毒感染。对于HPV16及18型阳性的患者建议直接转诊阴道镜，进行组织学活检。HPV检测可以作为TCT的有效补充，二者联合有利于提高筛查效率。但大部分HPV感染是一过性感染，因此HPV检测虽然敏感性高，但对于宫颈癌的检测特异性低。HPV感染并非等同于得宫颈癌，因此用HPV检测来筛查宫颈癌特异性低，存在过度诊疗。TCT检测是镜下观察脱落细胞形态来诊断宫颈癌，受取材和人为因素影响大，敏感性不高。
[0006]DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰。特定基因启动子区DNA异常甲基化是肿瘤形成的一个早期事件。宫颈脱落细胞DNA甲基化标志物检查是新兴的宫颈癌检测方法，已有报道在宫颈癌和癌前病变(CIN2/3)阶段有许多基因启动子区发生了异常甲基化。并且检测
这些DNA甲基化标志物可以作为宫颈癌的一种早期筛查诊断技术，报道较多的基因有ZNF582，PTPRR，PAX1，SOX1，EPB41L3和JAM3等。
[0007]现有一些DNA甲基化标志物用于宫颈癌检测存在的问题：1)检测试剂中靶基因太多，多为标志物组合，2)敏感性和特异性不高。比如，有试剂盒(GynTect)需要同时检测6个基因(DLX、ITGA4、RXFP3、SOX17、ZNF671和ASTN1)DNA甲基化程度，来评估HPV检测阳性患者的癌变转化风险。还有试剂盒需要同时检测SOX1和PAX1来辅助诊断宫颈癌和癌前病变。上述GynTect检测宫颈癌的敏感性虽然有100％(5/5)，但其特异性只有84.6％(137/162)。另有同类产品通过检测EPB41L3和JAM3甲基化来检测CIN2+(CIN2、CIN3和宫颈癌)，其性能为对CIN2+的敏感性为72.13％，特异性为91.53％。

技术实现思路

[0008]一方面，本申请提供了一种引物，所述引物选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13所示的序列或其互补序列中的至少任意一条。
[0009]在一些实施方案中，所述引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：
[0010]7、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13所示的任意一对引物对。
[0011]在一些实施方案中，所述引物选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6，或SEQ IDNO：12和SEQ ID NO：13所示的引物对。
[0012]在一些实施方案中，所述引物选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6所示的引物对。
[0013]一方面，本申请提供了一种探针，所述探针选自SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：11所示的序列，和它们的互补序列中的至少任意一条.
[0014]在一些实施方案中，所述探针选自SEQ ID NO：3所示的序列或其互补序列。
[0015]在一些实施方案中，本申请提供了所述的引物和/或探针在制备甲基化(例如OPCML的甲基化)检测试剂中的应用，或者制备宫颈病变检测试剂中的应用。
[0016]本领域公知，引物的成功设计对于PCR是至关重要。相对于一般的PCR，在甲基化检测中，引物的设计影响更为关键，这是由于甲硫化反应促使DNA链中的“C”转化为“U”，导致GC含量降低，使PCR反应后在序列中出现长的连续“T”，容易引起DNA链的断裂，导致很难选择具有合适的Tm值及稳定的引物；另一方面，为了区别硫化处理和没有硫化处理以及未完全处理的DNA，需要引物有足够数量的“C”，这些都增加了选择稳定引物的困难。因此，DNA甲基化检测中，引物所针对的扩增片段的选择，如扩增片段长短和位置，以及引物的选择等等都对检测的灵敏度和特异性产生影响。很多时候，发现了某些基因或核酸片段在肿瘤和非肿瘤中具有表达差异，然而其距离转化为肿瘤的标志物，应用到临床中，仍存在很长的距离。其中最主要的原因是因为检测试剂的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物，其特征在于，所述引物选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13所示的序列或其互补序列中的至少任意一条；优选地，所述引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的任意一对引物对；优选地，所述引物选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的引物对；优选地，所述引物选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6所示的引物对。2.一种探针，其特征在于，所述探针选自SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：11所示的序列，和它们的互补序列中的至少任意一条；优选地，所述探针选自SEQ ID NO：3所示的序列或其互补序列。3.如权利要求1或2所述的引物和/或探针在制备甲基化检测试剂中的应用，或者制备宫颈病变检测试剂中的应用。4.一种甲基化检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括OPCML甲基化检测的引物和/或探针：优选地，所述引物的上游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：I.具有SEQ ID NO：1、4、9或12任一所示的核苷酸序列；II.如I所示序列的互补序列；优选地，所述引物的下游引物具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：III.具有SEQ ID NO：2、5、6、7、8、10或13任一所示的核苷酸序列；IV.如III所示序列的互补序列；优选地，所述引物选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的任意一对引物对；优选地，所述引物选自SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的引物对；优选地，所述引物选自SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘相林，赖丽珊，柯焕春，邹鸿志，
申请(专利权)人：广州康立明生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：