一种Y染色体微缺失检测试剂盒制造技术

本实用新型专利技术涉及一种Y染色体微缺失检测试剂盒。其中试剂盒包括：盒体、PCR反应液I、PCR反应液II、阳性对照、阴性对照,空白对照。该试剂盒利用Taqman荧光探针PCR法检测Y染色体AZFa亚区sY84和sY86位点，Y染色体AZFb亚区sY127和sY134位点，Y染色体AZFc亚区sY254和sY255位点的基因缺失。该试剂盒采用针对检测位点设计的特异性引物探针实现对检测位点的高效稳定的多重PCR检测，并通过利用不同荧光基团对各检测位点探针的标记进而达到指示目标片段是否缺失的情况，从而实现在2管反应液中同时检测6个AZF缺失位点以及每管反应液均同时检测SRY和ZFY内控基因。采用本实用新型专利技术试剂盒可对男性Y染色体微缺失的6个位点进行检测，具有准确、快速、高通量和无污染等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及染色体缺失检测领域，尤其涉及一种Y染色体微缺失检测试剂盒。
技术介绍
据估计不育症困扰着世界上超过10％的育龄夫妇,其中男性因素占了一半。引起男性不育的病因有很多,包括感染、生殖器官畸形、免疫功能异常、精索静脉曲张、勃起机能障碍、药物损伤以及染色体异常等。男性不育常伴随着精子数量减少,国内学者已对其进行了大量相关研究。Y染色体长臂无精子症因子(Azoospermiafactor,AZF)微缺失是导致男性生精障碍主要的遗传学因素之一。研究表明,亚洲地区男性不育患者中AZF微缺失的发生率在2％～19.4％之间,与研究对象纳入标准、序列标签位点(SequenceTagSite，STS)的选择、人群分布及遗传背景有关。AZF区微缺失的患者极少有自然生育能力,但近年来睾丸取精(Testicularspermextraction,TESE)和卵母细胞质内单精子注射(Intracytoplasmicsperminjection,ICSI)技术的发展,给无精子症、少精子症患者能够生育带来了希望,但也增加了将微缺失传递给下一代的风险。因此,对男性不育患者尽早进行Y染色体微缺失筛查有着重要意义,不仅可以明确患者真正病因,避免不必要的检查及无效的治疗,还可预知或者防止遗传缺陷的传递。Y染色体微缺失一般在染色体核型分析时不易发现，目前主要通过AZF区域的序列标签位点来诊断，根据欧洲男科协会建议的六个STS位点进行Y染色体微缺失的分析，即AZFa亚区sY84和sY86位点，Y染色体AZFb亚区sY127和sY134位点，Y染色体AZFc亚区sY254和sY255位点，对上述位点的分析，Y染色体微缺失的检测准确率可以达到95％。目前应用于检测Y染色体微缺失的技术主要为通过PCR方法对Y染色体AZF区域的序列标签位点进行特异性扩增，再用电泳或Southernblot杂交等方法对PCR产物进行检测，这两种检测方法虽技术成熟，但同时也都存在缺陷，电泳检测的方法准确率不高、灵敏度低，Southernblot杂交方法耗时耗力、成本较高且操作繁琐。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供一种Y染色体微缺失检测试剂盒。本专利技术提供一种Y染色体微缺失检测试剂盒，所述试剂盒包括盒体1、海绵衬垫2，所述的海绵衬垫2置于盒体1内，海绵衬垫2上设有多个容器孔并装有多个装有检测试剂的试剂管，分别为装有PCR反应液I的试剂管3、装有PCR反应液II的试剂管4、装有阳性对照的试剂管5、装有阴性对照的试剂管6，装有空白对照的试剂管7。本专利技术根据欧洲男科协会建议的六个STS位点和SRY及ZFY内参基因设计特异性引物和探针，通过Taqman荧光PCR法对其进行多重检测，可以快速、准确地检测Y染色体微缺失。根据本专利技术的实施例，本专利技术提供一种用于Y染色体微缺失检测的引物和探针，所述引物和探针包括8组，可同时扩增检测Y染色体微缺失的六个STS位点和SRY及ZFY内参基因,所述引物探针组合包括用于检测SY84位点的引物探针组合、用于检测SY86位点的引物探针组合、用于检测SY127位点的引物探针组合、用于检测SY134位点的引物探针组合、用于检测SY254位点的引物探针组合、用于检测SY255位点的引物探针组合、用于检测SRY内参基因的引物探针组合以及用于检测ZFY内参基因的引物探针组合。所述的该试剂盒中反应液分为反应液I和反应液II，其中反应液I中含有检测SY84位点、SY127位点、SY255位点、SRY和ZFY基因的引物探针组合，其中反应液II中含有SY86位点、SY134位点、SY254位点、SRY和ZFY基因的引物探针组合。所述的PCR反应液I和PCR反应液II中SRY和ZFY基因的引物探针组合用于质控。所述的PCR反应液I和PCR反应液II中用于检测SY84位点、SY86位点、SY254位点、SY255位点、SRY和ZFY基因的引物浓度均为200nM，探针浓度均为100nM，用于检测SY127位点、SY134位点的引物浓度均为200nM，探针浓度均为300nM。所述的PCR反应液I和PCR反应液II中还包含有MgCL2、Taq酶、dUTP、dATP、dCTP、dGTP、UDG酶、10×PCRBuffer。所述的MgCL2反应终浓度为4.5mM。所述的Taq酶反应终浓度为5U。所述的dUTP、dATP、dCTP、dGTP反应终浓度为0.5mM。所述的UDG酶反应终浓度为0.3U。所述的10×PCRBuffer反应终浓度为1×PCRBuffer。进一步的本专利技术采用Taqman荧光探针PCR技术对Y染色体微缺失进行五重荧光检测。本专利技术的有益效果是：本试剂盒和方法采用实时荧光定量PCR结合Taqman探针对Y染色体微缺失SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点进行多重荧光检测，内参基因SRY和ZFY基因检测的加入可有效控制本专利技术试剂盒和方法对Y染色体微缺失检测结果的有效性，该方法操作简单、检测通量高、快速、灵敏度高且特异性强，可有效缩短检测周期和成本。附图说明图1为本专利技术的Y染色体微缺失检测试剂盒结构示意图；图2为PCR反应液I中SY84、SY127、SY255位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；图3为PCR反应液II中SY86、SY134、SY254位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；图4为PCR反应液I中SY127、SY255位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；图5为PCR反应液II中SY134、SY254位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；图6为PCR反应液I中SY84、SY255位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；图7为PCR反应液II中SY86、SY254位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；图8为PCR反应液I中SY84、SY127位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线；图9为PCR反应液II中SY86、SY134位点和SRY、ZFY基因的扩增曲线。具体实施方式本专利技术提供一种Y染色体微缺失检测试剂盒，如图1所示，所述试剂盒包括盒体1、海绵衬垫2，所述的海绵衬垫2置于盒体1内，海绵衬垫2上设有多个容器孔并装有多个装有检测试剂的试剂管，分别为装有PCR反应液I的试剂管3、装有PCR反应液II的试剂管4、装有阳性对照的试剂管5、装有阴性对照的试剂管6，装有空白对照的试剂管7。本专利技术采用五重荧光PCR方法分两管对Y染色体微缺失进行检测，检测位点包括SY84位点、SY86位点、SY127位点、SY134位点、SY254位点、SY255位点，其中PCR反应液I检测位点为SY84位点、SY127位点、SY255位点和SRY以及ZFY内参基因，其中PCR反应液II检测位点为SY86位点、SY134位点、SY254位点、SRY和ZFY内参基因，阳性对照采用正常已育男性DNA样本，阴性对照采用女性DNA样本，空白对照采用灭菌水以防止体系被污染。所述的SY84位点、SY86位点引物探针组合用于检测Y染色体AZFa区域是否存在缺失情况。所述的SY127位点、SY134位点引物探针组合用于检测Y染色体AZFb区域是否存在缺失情况。所述的SY254位点、SY255位点引物探针组合用于检测Y染色体AZFc区域是否存在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Y染色体微缺失检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括盒体(1)、海绵衬垫(2)，所述的海绵衬垫(2)置于盒体(1)内，海绵衬垫(2)上设有多个容器孔并装有多个装有检测试剂的试剂管，分别为装有PCR反应液I的试剂管(3)、装有PCR反应液II的试剂管(4)、装有阳性对照的试剂管(5)、装有阴性对照的试剂管(6)，装有空白对照的试剂管(7)。

【技术特征摘要】
1.一种Y染色体微缺失检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括盒体(1)、海绵衬垫(2)，所述的海绵衬垫(2)置于盒体(1)内，海绵衬垫(2)上设有多个容器孔并装有多个装有检测试剂的试剂管，分别为装有PCR反应液I的试剂管(3)、装有PCR反应液II的试剂管(4)、装有阳性对照的试剂管(5)、装有阴性对照的试剂管(6)，装有空白对照的试剂管(7)。2.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：卿志荣，郑帮，
申请(专利权)人：江苏睿玻生物科技有限公司，
类型：新型
国别省市：江苏;32