本发明专利技术公开了一种检测Y染色体微缺失的实时荧光定量PCR试剂盒及方法，其包括盒体、PCR反应液及至少一个引物探针组合，所述引物探针组合选自用于检测SY84位点的SY84引物探针组合、用于检测SY86位点的SY86引物探针组合、用于检测SY127位点的SY127引物探针组合、用于检测SY134位点的SY134引物探针组合、用于检测SY254位点的SY254引物探针组合及用于检测SY255位点的SY255引物探针组合。该试剂盒和方法利用实时荧光定量PCR结合Taqman探针对Y染色体微缺失位点进行检测，实时荧光定量PCR通过PCR扩增对每一个循环产物荧光信号进行实时收集，从而实现对起始模板定量及定性的分析，该方法操作简单、快速、检测通量高且敏感性特异性高，能够有效减少时间和成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测Y染色体微缺失的试剂盒及方法。
技术介绍
据统计，全世界有15 %的夫妇患有不育(孕)症，其中50 %以上由男方所致。近年来研究表明30%以上的男性不育是由于遗传因素引起的生精障碍，通常表现为男性Y染色体长臂(q臂)11区上无精因子基因家族(Azoospermia factor, AZF)多个位点的缺失突变，其中任何一个座位的微缺失都可导致生精障碍，而对于因Y染色体微缺失引起的男性不育是无法治疗的。在胞质内单精子注射(ICSI)技术辅助生育治疗前检测Y染色体微缺失可以为临床治疗提供指导，减少不必要的经济浪费。目前欧洲、美国及我国相关学会已经建议将检测Y染色体微缺失列为男性不育的筛查项目。 目前检测基因微缺失的方法很多，最常用的PCR-RFLP法，另外还有反向点杂交法、等位基因特异性聚合酶链反应、直接测序法等。后者是所有方法的金标准，但由于其费用昂贵，未广泛使用。而PCR-RFLP法虽然费用较低，操作简单，但特异性和敏感性都不太理想，其检测通量小，对于样本量较大的临床检测不适用。
技术实现思路
本专利技术提供一种能够有效减少时间和成本的用于检测Y染色体微缺失的试剂盒及方法。本专利技术提供一种用于检测Y染色体微缺失的实时荧光PCR试剂盒，包括盒体、PCR反应液及至少一个引物探针组合，所述引物探针组合选自用于检测SY84位点的SY84引物探针组合、用于检测SY86位点的SY86引物探针组合、用于检测SY127位点的SY127引物探针组合、用于检测SY134位点的SY134引物探针组合、用于检测SY254位点的SY254引物探针组合及用于检测SY255位点的SY255引物探针组合，其中，SY84引物探针组合的上游引物如SEQ ID NOiTSEQ ID NO:8中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:9 SEQ ID NO: 14中之一所示，其荧光探针如SEQ IDN0:15 SEQ ID NO: 22中之一所示；SY86引物探针组合的上游引物如SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:28中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:29 SEQ ID NO:30中之一所示，其荧光探针如SEQ ID N0:31 SEQ IDNO:39中之一所示；SY127引物探针组合的上游引物如SEQ ID N0:4(TSEQ ID NO: 51中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:52 SEQ ID NO:54中之一所示，其荧光探针如SEQ ID N0:55 SEQ IDNO:58中之一所示；SY134引物探针组合的上游引物如SEQ ID N0:59 SEQ ID NO:61中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:62 SEQ ID NO:69中之一所示，其荧光探针如SEQ ID N0:70 SEQ IDNO:74中之一所示；SY254引物探针组合的上游引物如SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 76中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:77 SEQ ID NO:85中之一所示，其荧光探针如SEQ ID N0:86 SEQ IDNO:87中之一所示；SY255引物探针组合的上游引物如SEQ ID N0:88 SEQ ID NO:90中之一所示，其下游引物如SEQ ID NO:9Tseq ID NO:94中之一所示，其荧光探针如SEQ ID N0:95 seq idNO: 101中之一所示。不同的引物探针组合用于检测Y染色体AZF区域的不同位点，可以根据需要选择检测其中的一个或多个位点，对应的，选择与该位点对应的引物探 针组合。Y染色体的AZF区域由AZFa区域、AZFb区域和AZFc区域组成。所述试剂盒还包括用于检测男性性别决定基因SRY的SRY引物探针组合，所述SRY引物探针组合的上游引物如SEQ ID NO: 102 SEQ ID NO: 107中之一所示，其下游引物如SEQID NO: 108 SEQ ID NO: 109 中之一所示，其荧光探针如 SEQ ID NO: IlO^SEQ ID NO: 112 中之一所示。SRY引物探针组合用于质控，其可以根据检测要求选择采用或不采用。所述引物探针组合由SY84、SY86、SY127、SY134、SY254、和SY255引物探针组合组成，所述引物之间Tm值相差波动于2-4°C，所述探针之间Tm值相差波动于2_4°C，引物探针之间Tm值相差为10°C左右。引物包括针对各位点的引物和针对基因SRY的引物。探针包括针对各位点的探针和针对基因SRY的探针。所述PCR反应液还包括含MgCl、KCl、Tris的10倍缓冲液(10*Buffer)、含dATP、dCTP、dGTP、dUTP 的 dNTP 及 rTaq 酶。其中，MgCl浓度为 I. 5mM, KCl 浓度为 60mM、Tris 浓度为 12mM。其中，dNTP浓度为 O. 2mM。其中，合成引物浓度为300uM、探针浓度为100uM。一种用于检测Y染色体微缺失的方法，包括如下步骤a)从人抗凝血中提取基因组DNA ；b)以所述基因组DNA试样为模板，利用权利要求7所述的SY84、SY86、SY127、SY134、SY254和SY255引物探针组合进行PCR扩增及检测；c)根据探针荧光标记选择对应探针检测通道的颜色；d)根据扩增曲线颜色及曲线有无判断对应Y染色体的AZF区域是否存在缺失。其中，该方法采用四重荧光定量PCR分两管对Y染色体3个区域6个位点进行检测。本专利技术的有益效果是该试剂盒和方法利用实时荧光定量PCR结合Taqman探针对Y染色体微缺失位点进行检测，实时荧光定量PCR通过PCR扩增对每一个循环产物荧光信号进行实时收集，从而实现对起始模板定量及定性的分析，该方法操作简单、快速、检测通量高且敏感性特异性高，能够有效减少时间和成本。附图说明图1-10是表明本实施方式检测结果的荧光扩增曲线图，其中，图I的4条曲线分别表示SRY、SY84、SY127和SY254位点的扩增曲线；图2的4条曲线分别表示SRY、SY134、SY255和SY86位点的扩增曲线；图3的3条曲线分别表示SRY、SY127和SY254位点的扩增曲线；图4的3条曲线分别表示SRY、SY134和SY255位点的扩增曲线；图5的3条曲线分别表示SRY、SY84和SY254位点的扩增曲线；图6的4条曲线分别表示SRY、SY86、SY134和SY255位点的扩增曲线；图7的3条曲线分别表示SRY、SY86和SY255位点的扩增曲线；图8的4条曲线分别表示SRY、SY84、SY127和SY254位点的扩增曲线； 图9的3条曲线分别表示SRY、SY84和SY127位点的扩增曲线；图10的3条曲线分别表示SRY、SY86和SY134位点的扩增曲线。具体实施例方式本专利技术运用四重荧光定量PCR分两管对Y染色体AZFa区域的SY84位点和SY86位点、对AZFb区域的SY127位点和SY134位点、对AZFc区域SY254位点和SY255位点进行检测，同时检测男性性别决定基因SRY作为质控，以正常已育男性DNA样本作为阳性对照，女性DNA样本作为阴性对照，灭菌水作为空白对照防止检验体系被污染。用于检测Y染色体AZ本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测Y染色体AZFa区域SY84位点缺失的引物探针组合，包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针，其特征在于：所述上游引物如SEQ？ID？NO:1~SEQ？ID？NO:8中之一所示，所述下游引物如SEQ？ID？NO:9~SEQ？ID？NO:14中之一所示，所述荧光探针如SEQ？ID？NO:15~SEQ？ID？NO:22中之一所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：骆子义，邬宇美，
申请(专利权)人：骆子义，邬宇美，
类型：发明
国别省市：
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