用于鉴别甘薯染色体的两个DNA重复序列及FISH鉴别方法技术

本发明专利技术公开了用于鉴别甘薯染色体的两个DNA重复序列及FISH鉴别方法，属于细胞遗传学和分子生物学技术领域。所述序列是SEQ NO：1所示的核苷酸序列Itf_1和SEQ NO：2所示的核苷酸序列Itf_2。所述方法为提取质粒DNA后，通过缺刻平移法，用生物素标记的Itf_1和用地高辛标记的Itf_2，形成Itf_1和Itf_2探针，经过染色体片的制备、荧光原位杂交、信号检测等步骤，有效地解决了甘薯因染色体较小，数目较多，细胞质浓厚和染色能力弱等问题而不能通过传统的方式进行分辨识别的难题，探针的荧光信号强，易于检测，且重复性高，能直观、简便、快速、有效地鉴别甘薯染色体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞遗传学和分子生物学
，具体涉及鉴别甘薯染色体的两个DNA重复序列及FISH鉴别方法。
技术介绍
甘薯是旋花科甘薯属植物，富含淀粉、蛋白质、纤维素、β-胡萝卜素和多种维生素，被世界卫生组织列为13种最佳蔬菜的冠军。在亚、非、拉美等热带及亚热带地区广为栽培，是一种重要的粮食、蔬菜、工业原料作物及新型能源作物。近年来，甘薯在能源、健康食品、饲料等方面的价值越来越受到人们的重视，已经培育出了很多新型优良品种。甘薯属植物染色体的基础研究薄弱，相对滞后于水稻、小麦等其他作物。甘薯属植物染色体有2×、4×、6×三种倍性，栽培种基本为6×。其染色体较小，数目较多，细胞质浓厚和染色能力弱，较难获得清晰干净的染色体制片，难以从细胞遗传学水平进行研究。目前的研究主要集中在染色体数目与减数分裂行为的观察，对甘薯多倍体的染色体组成和结构研究甚少。显带技术和原位杂交技术(ISH)是研究染色体组成和结构比较重要的两种技术。显带技术主要是通过不同染色体的常异染色质的位置区分。原位杂交技术主要有基因组原位杂交技术(GISH)和荧光原位杂交技术(FISH本文档来自技高网...

【技术保护点】
鉴别甘薯染色体的两个DNA重复序列，其特征在于，序列1具有SEQ NO：1所示的核苷酸序列，序列2具有SEQ NO：2所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.鉴别甘薯染色体的两个DNA重复序列，其特征在于，序列1具有SEQ NO：
1所示的核苷酸序列，序列2具有SEQ NO：2所示的核苷酸序列。
2.一种利用权利要求1所述DNA重复序列鉴别甘薯染色体的荧光原位杂
交方法，其特征在于，质粒DNA提取后，通过缺刻平移法，用生物素标记的Itf_1
和用地高辛标记的Itf_2，形成Itf_1和Itf_2探针，用于对甘薯染色体的鉴别，具
体步骤包括：
1)染色体片的制备
按常规植物材料培养，待植株根尖长至0.5-1cm时，切下生长旺盛的根尖，
经8-羟基喹啉在25℃下处理2h后，用卡诺氏固定液固定24h；去离子水冲洗浸
泡30min，充分洗去固定液；用含2％纤维素酶和1％果胶酶的纤维素果胶酶在
37℃酶解1-2h；去离子水冲洗浸泡30min，充分洗去酶液；取1-2根尖于干净玻
片上，用镊子尖端敲碎根尖，悬空滴加卡诺氏固定液使其充分散开，酒精灯上烤
一下，晾干；镜检，选择分散良好的染色体片-20℃保存；
2)荧光原位杂交
①烤片：杂交之前，将制好的片子置于65℃烘箱中干燥30-60min；
②杂交液的配制：取ssDNA4μL和Itf_1，Itf_2探针DNA各3μL，混匀后
于65℃烘箱中烘至4μL，再加入70％去离子甲酰胺10μL、50％硫酸葡聚糖4μL、
20×SSC 2μL混匀，封口膜封好备用；
③变性液的配制：取双蒸水20μL、20×SSC10μL、70％去离子甲酰胺70μL，
混匀，封口膜封好备用；
④探针变性：取出烘箱中的染色体片，将烘箱升温至85℃，将上述变性液
加于取出的载玻片上，加上盖玻片；85℃烘箱中变性2-4min；甩掉盖玻片，立
即依次浸入-20℃70％、95％、100％的冰乙醇中各5min；取出玻片，空气中干
燥30min以上；
⑤杂交：将杂交液放入沸水中变性10min，迅速置于冰上冷却10min，加于
上一步干燥后的载玻片上，盖上盖玻片，室温5-10min；置于80-85℃烘箱中变
性2min，放入培养皿中，置于37℃培养箱中培养17-21h；
⑥杂交后洗脱：取出培养箱中的玻片，置于2×SSC中脱色摇床上室温洗脱
2×5min；置于42℃2×SSC中洗脱10min；2×SSC中脱色摇床上再次洗脱5min；

\t1×TNT中脱色摇床上洗脱5min，晾干；剪取和玻片大小...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宗芸，俞立璇，韩永华，陈孚尧，孙健英，董婷婷，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32