本发明专利技术涉及一种基于定量PCR技术确定滩涂贝类幼体摄食选择性差异的分析方法，通过对某种滩涂贝类投喂一定数量的混合微藻，摄食一段时间后对摄食前后滩涂贝类体内的各微藻进行定量PCR分析，根据各微藻在贝类体内的比例变化确定该滩涂贝类对不同微藻选择性摄食的差异。本发明专利技术特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确，避免了由于贝类浮游或稚贝阶段幼体太小，无法用传统光学显微镜对胃含物进行解剖观察的缺陷；也弥补了颗粒计数仪在浑浊水体中，无法将各种无机、有机颗粒跟微藻颗粒区分开，更无法区分开粒度接近的微藻的不足。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水产养殖饵料培养
，涉及一种基于定量PCR技术确定滩涂贝类幼体摄食选择性差异的方法，具体是一种基于定量PCR技术，通过定量检测滩涂贝类幼体摄食混合微藻前后贝类体内各微藻组成的变化，来准确分析贝类对微藻的摄食选择性差异的方法。
技术介绍
目前我国“蛤、蚶、蛏”等滩涂贝类产量约为400万吨，占海水贝类养殖总产量近40%。而在滩涂贝类育苗和养殖过程中，微藻饵料的品种和质量直接决定着育苗和养殖的成败。长期实践发现，不同海区不同贝类生长状况明显不同，育苗过程中投喂不同微藻时，贝类生长速度差异很大，说明滩涂贝类对微藻饵料有着明显选择性也许是研究方法限制，迄今还未见浮游和稚贝阶段贝类对粒度适宜微藻摄食选择性专利技术研究报道。由于贝类浮游或稚贝阶段幼体太小，无法用传统光学显微镜对胃含物进行解剖观察；颗粒计数仪可观察水体中不同粒度微藻或细菌的适时变化，但实际浑浊水体中，该类仪器无法将各种无机、有机颗粒跟微藻颗粒区分开，更无法区分开粒度接近的微藻。实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点，在水产行业已逐渐应用在养殖病害诊断、水产品检测及养殖水环境实时监测等领域。艮道表明,该技术在浮游动物馆料摄食的选择性定性定量研究上有着其他技术无法比拟的优势。对微藻而言，其rDNA基因具高保守性，据微藻的rDNA的部分区域设计引物与探针并结合实时荧光定量PCR技术，便可对各微藻进行准确定量分析。本专利技术应用该技术，可避免传统技术的不足，通过对幼体摄食混合微藻前后贝类体内微藻组成进行实时荧光定量PCR，就可准确分析贝类对微藻的摄食选择性差异。
技术实现思路
针对传统技术的不足，本专利技术提供了一种基于定量PCR技术，通过定量检测滩涂贝类稚贝摄食混合微藻前后贝类体内各微藻组成的变化，来准确分析贝类对微藻的摄食选择性差异的分析方法。为实现以上目的，本专利技术提供了如下技术方案一种基于定量PCR技术确定滩涂贝类摄食选择性差异的分析方法，其特征在于对某种滩涂贝类投喂一定数量的混合微藻，摄食一段时间后对摄食前后滩涂贝类体内的各微藻进行定量PCR分析，根据各微藻在贝类体内的比例确定该滩涂贝类对不同微藻选择性摄食的差异。本专利技术所述的滩涂贝类涉及泥蚶、毛蚶、青蛤、缢蛏、彩虹明樱蛤、文蛤等所有滩涂贝类品种。本专利技术所述的混合微藻品种可以是目前滩涂贝类苗种培育过程中常用的金藻、角毛藻、扁藻、微绿球藻、骨条藻、小硅藻、三角褐脂藻等，也可以是从天然水域分离出的任何单细胞藻。本专利技术所用的饵料微藻均于指数生长期进行投喂，即在接种后经过适宜条件培养Γιο天内用于投喂。混合微藻在投喂前，于20±2°C，光照强度为18 27 μ mo I · m_2 · s—1的条件下，在 锥形瓶中采用“NML3号”培养液，其配方为100±10mg · L—1 KNO3,10 ± Img · L—1 KH2PO4,20±2mg · L_1 Na2Si03，0. 25±0· 025mg · Γ1 MnSO4 · H2O, 2· 50 ±0. 25mg · Γ1 FeSO4 · 7H20，10 ± Img .171 EDTA-Na2,6± 0. 6μ g ·Ι^ VB1,0· 05 ±0. 005 μ g .171 VB12，进行人工扩大培养，每天摇瓶1-2次，静置培养一周时间，通过显微观察和颗粒计数板计数，待微藻细胞浓度达到80 120沈11 · μ Γ1，青岛大扁藻细胞密度控制在15 20cell · μ L-1时，微藻处于指数生长期，此时方可投喂稚贝。本专利技术所述的滩涂贝类投喂混合微藻前，需要在经过沙滤基本不含任何微藻的洁净天然海水中不投饵饥饿8-lOh以尽量排空肠胃内残饵，后取lg±0. Ig湿重的稚贝样品并于_20°C以下冷冻保存以进行后续定量PCR分析。本专利技术所述的饵料投喂过程中，取一定数量某种滩涂贝类稚贝于一定体积的塑料容器内，投喂一定量的混合微藻，投喂后取20 ± O. 2mL左右的培养海水用O. 45 ±O. 045 μ m醋酸纤维滤膜过滤收集混合微藻样品并于_20°C以下冷冻保存以进行后期混合微藻的定量PCR分析；摄食O. 5-lh后取I. 0±0. 2g左右湿重的贝类样品并于-20°C以下冷冻保存以进行定量PCR分析。本专利技术所述的混合微藻，需要分别对其18S rDNA进行克隆、测序及序列分析，并获得能够通过PCR扩增技术来区分此5种微藻的特异性引物(探针)。它们为ChaF/ChaR、IsoF/IsoR、PlaF/PlaR、PavF/PavR 及 NanF/NanR。本专利技术中对滩涂贝类幼体体内和水体中的混合微藻进行定量PCR分析时，须根据各饵料微藻的特异性引物分别对其基因组DNA进行PCR扩增并获得目标片段，以10倍拷贝数为浓度梯度的目标片段构建标准品系列，通过优化定量PCR反应体系和反应条件，建立荧光信号(正比于目标片段的拷贝数)相对Ct值的定量工作曲线(标准曲线)。后通过检测混合微藻中及摄食前后稚贝体内各微藻的Ct值，依据各自的工作曲线分别计算出各样品中各微藻的含量(以目标片段拷贝数表示)，从而确定各微藻在样品的相对比例，最终根据比较水体中初始混合微藻的比例和贝类体内摄食前后各微藻在混合微藻中的比例，确定出该滩涂贝类稚贝的对混合微藻中各微藻的摄食选择性差异。本专利技术建立的微藻或贝类中混合微藻的定量PCR方法，由于仪器本身检测系统存在的误差，每次样品的检测结果均须配以标准品及阴性对照加以校正，消除本底信号的干扰，其方法灵敏度要远远大于普通PCR的琼脂糖凝胶电泳结果。与现有技术相比，本专利技术的优点在于特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确，对个体微小的滩涂贝类品种的摄食选择性分析研究，具有其他技术无法比拟的优势。避免了由于贝类浮游或稚贝阶段幼体太小，无法用传统光学显微镜对胃含物进行解剖观察的缺陷；也弥补了颗粒计数仪在浑浊水体中，无法将各种无机、有机颗粒跟微藻颗粒区分开，更无法区分开粒度接近的微藻的不足。附图说明图Ia. 5种惧料微藻中角毛藻(Chaetoceros calcitrans)的FQ-PCR扩增的标准曲线；图Ib. 5种惧料微藻中球等鞭金藻(Isochrysis galbana)的FQ-PCR扩增的标准曲线；图Ic. 5种惧料微藻中青岛大扁藻(Platymonas helgolandica)的FQ-PCR扩增的标准曲线； 图Id. 5种惧料微藻中绿色巴夫藻(Pavlova viridis)的FQ-PCR扩增的标准曲线.图Ie. 5种傅料微藻中微绿球藻(Nannochloropsis oculata)的FQ-PCR扩增的标准曲线；具体实施例方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。选择滩涂贝类常用5种海洋微藻，分别是硅藻门的角毛藻(ChaetoceiOscalcitrans)、金藻门的球等鞭金藻(Isochrysis galbana)和绿色巴夫藻(Pavlova viridis)、绿藻门的青岛大扁藻(Platymonas helgolandica)和微绿球藻(Nannochloropsis oculata),根据各微藻18S rDNA的序列可以设计出5对特异性引物(ChaF/ChaR、IsoF/IsoR、PlaF/PlaR本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于定量PCR技术确定滩涂贝类摄食选择性差异的分析方法，其特征在于：对某种滩涂贝类投喂一定数量的混合微藻，摄食一段时间后对摄食前后滩涂贝类体内的各微藻进行定量PCR分析，根据各微藻在贝类体内的比例确定该滩涂贝类对不同微藻选择性摄食的差异。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：芦文奇，徐继林，周海波，朱鹏，徐正贵，严小军，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：
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