【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种恒温扩增检测试剂盒，具体涉及一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒及其应用。
技术介绍
1、呼吸道病原体感染的症状大多数表现为发热、咳嗽、肿痛、头痛等症状，其临床表现与病毒感染、细菌感染所导致的临床表现相似，起病急、进展快、症状及体征不典型，因此对呼吸道病原体进行鉴别诊断，可快速明确引起呼吸道症状的病原体，从而让医生有针对性的制定治疗方案和健康管理措施，尽快治愈疾病，避免抗生素的过度使用。
2、目前检测呼吸道病原体的分子检测技术主要为基于dna检测的pcr荧光定量法。pcr荧光定量法一管检测灵敏度高但指标少，一般为1-4个指标，且检测dna无法判断病原体是否存活，可能存在假阳性结果。
3、以rna为检测模板的等温扩增技术目前主要是以amv为逆转录酶的基于核酸序列的扩增技术及以mmlv为逆转录酶的tma及sat扩增技术，该两种方法扩增原理几乎完全相同，只是逆转录酶种类存在差别。目前国内针对泌尿生殖道病原体检测主要应用的是tma及sat扩增技术。该两种方法的主要区别在于扩增产物的检测方法，tma主要在反应完成后对产物进行hpa及杂交保护检测，该检测方法由于在反应完成后仍然需要开盖进行检测，一定程度增加了污染的可能。sat检测则通过在反应体系中加入诸如分子信标等探针，对反应进行不开盖实时报告及检测技术(200810111479.0，核酸恒温同步放大检测方法及应用)，该方法可在扩增发生产物产生时利用分子信标进行实时检测，利用扩增曲线的有无进行结果的判断，该检测灵敏度高，且不开盖检测，
4、多通道溶解曲线技术是一种pcr终点检测技术，在pcr扩增结束之后，利用温度的升高实现探针与目的单链的逐渐解链，发生荧光值的变化，通过仪器生成探针熔解曲线。依靠探针tm值的差异，可以在同一管内实现多重检测，使用不同荧光标记的探针，即可实现多通道多重检测。如何将两个维度技术的结合是迫切需要解决的。
技术实现思路
1、为解决检测通量少、单指标检测成本较高的问题，本专利技术提供一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒。本专利技术是等温扩增结合溶解曲线的分析方法，不同于sat方法使用分子信标实时对反应进行荧光收集产生扩增曲线，进行同步放大检测方式。由于等温扩增的产物主要为rna单链，故可以反应完成后进行终点检测的溶解曲线分析进行检测，利用探针与单链rna产物杂交解离过程中所产生的的荧光值的突然变化，形成不同的溶解峰，从而达到判断是否存在探针结合的目标产物的目的。
2、本专利技术提供如下技术方案：
3、一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒，包括甲型h1n1型流感病毒、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎支原体，试剂盒包括：
4、1)扩增反应液：含10-150mm kcl，3-40mm mgcl2，10-150mm tris-hcl，0.1-5mmdntp,0.1-8mm ntp，3％-30％甘油，1-20mm dtt，0.1-5mm精氨酸，甲酰胺0.05-2mm 0.05-2μm扩增引物1，0.05-2μm扩增引物2；
5、扩增引物有八对：甲型h1n1型流感病毒、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎支原体，具体的：
6、(1)甲型h1n1型流感病毒的扩增引物：
7、iav-扩增引物1：gcgcagagactggaaagtg
8、iav-扩增引物2：aattctaatacgactcactatagggcgctcactgggcacggt
9、(2)肺炎克雷伯杆菌的扩增引物：
10、kp-扩增引物1：ctttgtggcttcaacagcg
11、kp-扩增引物2：aattctaatacgactcactataggggaaatagtgcatggctttgatc
12、(3)流感嗜血杆菌的扩增引物：
13、hi-扩增引物1：taagatttcccaggtgccag
14、hi-扩增引物2：ttccctcctatgcgttatgc
15、(4)乙型流感病毒的扩增引物：
16、ibv-扩增引物1：ggaggaccctacaaaattggaac
17、ibv-扩增引物2：
18、aattctaatacgactcactatagggggtcttctccytctgtacaaatgt
19、(5)呼吸道合胞病毒的扩增引物：
20、rsv-扩增引物1：rcttgcaggtgacaayaac
21、rsv-扩增引物2：aattctaatacgactcactataggggcatccatrgcttgtctttcatc
22、(6)肺炎衣原体的扩增引物：
23、cp-扩增引物1：ggttcactaatgcaggcttcat
24、cp-扩增引物2：
25、aattctaatacgactcactatagggactccgaataaaccaacgagattgaacg
26、(7)肺炎链球菌的扩增引物：
27、sp-扩增引物1：ctaagtcagcacttggtttcgt
28、sp-扩增引物2：
29、aattctaatacgactcactatagggcctctaatccttgcatgatttgacg
30、(8)肺炎支原体的扩增引物：
31、mp-扩增引物1：gagcttaggtctccgcttaga
32、mp-扩增引物2：aattctaatacgactcactataggggggaccttgactggaggcc
33、2)酶反应液：1-800u逆转录酶，10-1000u rna聚合酶，0-100u rna酶抑制剂，10％-50％甘油10-100mm tris-hcl，20-200mm kcl，0.1-5mm dtt，0.1-1μg/μl bsa，0-0.5u核糖核酸酶h；
34、3)探针0.05-2μm，探针是一种或多种荧光探针，荧光探针的类型为taqman荧光探针、分子信标或蝎型探针。
35、酶反应液中的四种酶如下：
36、rna聚合酶:t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、m13 rna聚合酶、sp6 rna聚合酶；
37、逆转录酶：amv反转录酶或mmlv反转录酶；
38、具有降解rna&dna杂交链中rna链活性的核糖核酸酶h；
39、抑制核糖核酸酶a，b，c的鼠源或人源的rna酶抑制剂。
40、扩增引物1与本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒，8种生殖病原体为甲型H1N1型流感病毒、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎支原体，其特征在于：试剂盒包括：
2.根据权利要求1所述的一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒，其特征在于：所述酶反应液含有的四种酶如下：
3.根据权利要求1所述的一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒，其特征在于：所述扩增引物1与目的核酸负链5'杂交的一段核酸序列；扩增引物2的5'端为RNA聚合酶启动子，3'端与目的核酸3'杂交的一段核酸序列。
4.根据权利要求1所述的一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒，其特征在于：所述探针一端标记有荧光基团，探针另一端标记有淬灭基团。
5.根据权利要求1所述的试剂盒在制备检测8种生殖病原体核酸检测试剂中的应用，其特征在于：8种生殖病原体为甲型H1N1型流感病毒、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎支原体。
【技术特征摘要】
1.一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒，8种生殖病原体为甲型h1n1型流感病毒、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎衣原体、肺炎链球菌、肺炎支原体，其特征在于：试剂盒包括：
2.根据权利要求1所述的一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒，其特征在于：所述酶反应液含有的四种酶如下：
3.根据权利要求1所述的一种利用溶解曲线检测8种呼吸道病原体恒温检测试剂盒，其特征在于：所述扩增引物1与目的核酸负链5'杂交的...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘昱辰，梁鑫浩，桑嘉欣，卿志荣，
申请(专利权)人：江苏睿玻生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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