一种用于平行测定尿嘧啶-DNA糖基化酶和内切酶IV活性的方法及其应用和试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种用于平行测定尿嘧啶-DNA糖基化酶和内切酶IV活性的方法及其应用和试剂盒。当目标物为UDG时，若UDG存在，所述发夹探针中的U碱基被移除，产生一个AP位点，产生的AP位点被工具酶EndoIV切刻，释放出含自由3’末端的引物序列用于引发随后的滚环放大反应RCA；若UDG不存在时，3’末端被封闭在所述发夹探针，RCA过程不能进行；当目标物为EndoIV时，若EndoIV存在，其RCA过程与上述UDG活性检测中的RCA过程是一样的，若EndoIV不存在时，3’末端被封闭在所述发夹探针，RCA过程不能进行。其既能用作UDG的识别探针又能用作EndoIV的前体识别探针，因此简化了探针的设计。UDG和EndoIV的检测限分别低至0.00017U/mL和0.11U/mL，结果比其他免标记荧光方法更好或相当。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药
，尤其涉及一种用于平行测定尿嘧啶-DNA糖基化酶和内切酶IV活性的方法及其应用和试剂盒。
技术介绍
尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)和内切酶IV(EndoIV)都是U碱基移除修复(UBER)酶，它们在保持基因组的完整性上具有重要作用。UDG和EndoIV能在修复DNA中的U碱基损伤时发挥协同功能，具体来讲，UDG移除U碱基损伤并产生无碱基(AP)位点，随后EndoIV切刻该AP位点。UBER酶的活性异常将抑制细胞对U碱基损伤的响应，这将导致各种相关疾病，包括免疫缺综合症，淋巴瘤，和布鲁姆综合症。研究表明，UBER酶的活性已成为上述疾病的一种有前途的生物标志物，并且对UBER酶的活性检测方法代表一种候选工具用于临床诊断及其功能研究。UBER酶活性的常用检测方法，包括凝胶电泳法，电化学法和比色法，分别受到放射性危害，复杂的电极修饰过程，或有限灵敏度的局限。作为另一种选择，荧光法因其安全和灵敏的特点而吸引了人们的广泛关注。为得到明显的荧光信号，已发展了许多基于标记的荧光策略用于UBER酶的活性检测，得到了令人满意的结果。然而，这些基于标记的荧光策略需要将荧光团或猝灭团共价捕获到DNA上，导致传感系统的生物相容性降低并对UBER酶的活性造成不利影响。为解决这个问题，一些免标记的荧光策略已被报道用于UBER酶的活性检测。含U碱基的DNA探针在UDG引发下能形成G-四倍体(G4)，这种探针已被设计用于UDG活性检测，并且当G4与金属复合物或N-甲基-卟啉IX(NMM)绑定时产生免标记的荧光信号。另外，Ma课题组提出了一种利用G4-选择性的金属复合物的免标记荧光策略实现了对EndoIV的活性检测。尽管上述免标荧光策略已实现了对UDG或EndoIV的活性检测，但是需设计不同的传感探针以实现对UDG和EndoIV的活性检测，这增加了探针设计的复杂性。因此，仍需发展一种基于同一探针的新型免标荧光策略用于平行检测UDG和EndoIV的活性。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术发展了一种基于一个独特发夹探针的新型免标记荧光策略用于平行测定UDG和EndoIV的活性(Scheme1)。设计了一个含U碱基和封闭的引物序列的双功能发夹探针用于目标物的识别和信号转导。具体讲，能发挥作用的RCA引物序列，应是以单链形式存在，能与环状模板杂交而引发RCA反应；而此处封闭的引物序列，是将引物序列设计在发夹结构的环部和颈部中，这样RCA的引物序列就不是以单链形式存在，而是有一部分存在于发夹颈部的双链结构中，因此也就不能与环状模板杂交而引发RCA反应了，即达到了封闭RCA引物序列的效果。本专利技术的特别之处还在于，目标物的识别方面，这个发夹探针既能用作UDG的识别探针又能用作EndoIV的前体识别探针。Scheme1A(图9A)阐述了这一策略用于检测UDG活性的原理，其中发夹探针用作UDG识别探针。UDG存在时，其识别探针中的U碱基被移除，产生一个AP位点。然后，产生的AP位点被工具酶EndoIV切刻，释放出含自由3’末端的引物序列。此处自由3’末端的引物序列是指，由于发夹颈部被切刻，发夹结构被破坏，导致原来存在于发夹环部和颈部的RCA引物序列此时是以单链的形式存在，该单链的末端是由于DNA链的切刻而产生的3’-OH。)用于引发随后的滚环放大(RCA)反应。将产生的探针与挂锁模板和T4DNA连接酶共同孵育之后，phi29DNA聚合酶和dNTPs的加入能引发RCA反应。RCA产物具有大量重复的富含G的序列，它在单价阳离子存在时能折叠成G4结构。当加入NMM时，G4和NMM的强烈相互作用能带来免标的荧光信号。相反地，当无目标物UDG存在时，引物序列仍被封闭在发夹探针中，因此RCA过程不能进行。另外，当发夹探针用作EndoIV的前体识别探针，这个策略又能被进一步用于EndoIV的活性检测。如Scheme1B(图9B)所示，利用工具酶UDG能移除U碱基而产生AP位点的性质，含U碱基的EndoIV的前体识别探针首先被转换成含AP位点的EndoIV的成熟识别探针。当存在目标物EndoIV时，它能切刻其成熟识别探针中的AP位点，释放出含自由3’末端的引物序列用于引发RCA反应，该过程与上述UDG活性检测中的RCA过程是一样的。由于RCA的信号放大能力，UDG和EndoIV的检测限分别低至0.00017U/mL、0.11U/mL。相对于它们相应的类似物，本策略对UDG和EndoIV也显示出更好的选择性。因此，本策略能提供一种简单的方法用于定量UDG和EndoIV的活性，有潜力用于临床诊断和它们的协同功能研究中。本专利技术一方面提供了一种用于平行测定尿嘧啶-DNA糖基化酶和内切酶IV活性的试剂盒，包括：发夹探针和挂锁模板；所述发夹探针包括环部、颈部，所述颈部连接于环部的两端且具有互补的核酸序列，所述颈部具有U碱基序列，所述发夹探针具有设计在发夹结构的环部和颈部的RCA的引物序列；所述挂锁模板具有与自由3’末端的引物序列特异结合引发滚环放大反应的序列。本专利技术中“封闭的序列”，是RCA的引物序列，该序列与后续环状模板的一部分序列是互补的；其次，3’-OH端存在于每条DNA链的一端，此处当发夹颈部被切刻而破坏发夹结构后，原本存在于发夹环部和颈部的RCA引物序列此时以单链的形式存在，该单链的末端是新形成的3’-OH端。优选的，当目标物为UDG时，若UDG存在，所述发夹探针中的U碱基被移除，产生一个AP位点，产生的AP位点被工具酶EndoIV切刻，释放出含自由3’末端的引物序列用于引发随后的滚环放大反应RCA；若UDG不存在时，3’末端序列被封闭在所述发夹探针，RCA过程不能进行；当目标物为EndoIV时，若EndoIV存在，其RCA过程与上述UDG活性检测中的RCA过程是一样的，若EndoIV不存在时，3’末端被封闭在所述发夹探针，RCA过程不能进行。优选的，所述发夹探针的序列：GTGGTGAGGAGTGAGGTAGGTGGTATAAACTTAGGATCGTGTGGTTUATACCACCTACCTCACTCCTCACCAC；所述挂锁模板的序列：GATCCTAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAACCACAC。本专利技术的第二个目的是提供一种用于平行测定尿嘧啶-DNA糖基化酶和内切酶IV活性的方法，包括如下步骤：1)设计发夹探针和挂锁模板；所述发夹探针包括环部、颈部，所述颈部连接于环部的两端且具有互补本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于平行测定尿嘧啶‑DNA糖基化酶和内切酶IV活性的试剂盒，其特征在于，包括：发夹探针和挂锁模板；所述发夹探针包括环部、颈部，所述颈部连接于环部的两端且具有互补的核酸序列，所述颈部具有U碱基序列，所述发夹探针具有设计在发夹结构的环部和颈部的RCA的引物序列；所述挂锁模板具有与自由3’末端的引物序列特异结合引发滚环放大反应的序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于平行测定尿嘧啶-DNA糖基化酶和内切酶IV活性的试剂盒，其特征在于，包
括：发夹探针和挂锁模板；所述发夹探针包括环部、颈部，所述颈部连接于环部的两端且具
有互补的核酸序列，所述颈部具有U碱基序列，所述发夹探针具有设计在发夹结构的环部和
颈部的RCA的引物序列；所述挂锁模板具有与自由3’末端的引物序列特异结合引发滚环放
大反应的序列。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发夹探针的颈部被切刻、发夹结构被
破坏后，存在于发夹环部和颈部的RCA引物序列以单链的形式存在，该单链的末端是由于
DNA链的切刻而产生的3’-OH，即所述自由3’末端的引物序列。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，当目标物为UDG时，若UDG存在，所述发夹探
针中的U碱基被移除，产生一个AP位点，产生的AP位点被工具酶EndoIV切刻，释放出含自由
3’末端的引物序列用于引发随后的滚环放大反应RCA；若UDG不存在时，3’末端被封闭在所
述发夹探针，RCA过程不能进行；当目标物为EndoIV时，若EndoIV存在，其RCA过程与上述UDG
活性检测中的RCA过程是一样的，若EndoIV不存在时，3’末端被封闭在所述发夹探针，RCA过
程不能进行。
4.如权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，
所述发夹探针的序列：
GTGGTGAGGAGTGAGGTAGGTGGTATAAACTTAGGATCGTGTGGTTUATACCACCTACCTCACTCCTCACCAC
；
所述挂锁模板的序列：
GATCCTAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAAAACCCAACCCGCCCTACCCAACCAC
AC。
5.一种用于平行测定尿嘧啶-DNA糖基化酶和内切酶IV活性的方法，其特征在于，包括
如下步骤：
1)设计发夹探针和挂锁模板；所述发夹探针包括环部、颈部，所述颈部连接于环部的两
端且具有互补的核酸序列，所述颈部具有U碱基序列，所述发夹探针具有设计在发夹结构的
环部和颈部的RCA的引物序列；所述挂锁模板具有与自由3’末端的引物序列特异结合引发
滚环放大反应的序列；
2)将步骤1)制备的发夹探针，待检测的UDG和相应的EndoIV加入到反应缓冲液中，若
UDG存在，所述发夹探针中的U碱基被移除，产生一个AP位点，产生的...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜玮，王磊，吴玉姝，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37