本发明专利技术涉及一种焦磷酸测序法检测VKORC1基因分型的引物对及试剂盒，属于体外核酸检测技术领域。所述引物对包括VKORC1 G1639A及VKORC1 C1173T正向扩增引物、VKORC1 G1639A及VKORC1C1173T反向扩增引物、VKORC1 G1639A及VKORC1 C1173T测序引物，所述VKORC1 G1639A正向扩增引物及所述VKORC1 C1173T反向扩增引物的5’端分别进行生物素标记；所述试剂盒包括扩增引物、PCR反应液1、PCR反应液2、测序引物、尿嘧啶DNA糖基化酶及Taq聚合酶。本发明专利技术提供的所述试剂盒具有检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单并能有效满足临床检验要求的优点；此外，还具有可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及体外核酸检测
，尤其设及一种焦憐酸测序法检测VKORCl基 因分型的引物对及试剂盒。
技术介绍
维生素K环氧化物还原酶复合体 1(VitaminKepoxidereductasecomplex subunitLVKORCl)是维生素K代谢循环中的关键酶，华法林因抑制该酶而阻断维生素KW 辅助因子形式参与簇化酶的催化反应，抑制了凝血因子II、W、IX、X的功能活性，从而产生 抗凝作用。国内外大量研究发现，VKORCl基因突变会增加该酶对华法林的敏感性，从而增 强抗凝效果，其中比较常见的突变有启动子区的G1639A突变及1号内含子的C1173T突变。 此外，研究表明，G1639A位点与华法林抗凝疗效具有显著的相关性，其中携带突变的患者所 需相对低的华法林剂量。VKORC1基因可分为A、B两组单体型，A组与华法林低剂量相关，B组与高剂量相关。 亚洲人中A组单体型的频率高达85% -89%，研究较多的SNP位点有内含子11730T和5' 上游区的1639G〉A。目前研究已经证实1639G〉A和11730T两个位点是完全连锁的。华法 林的作用途径是通过抑制维生素K在肝脏细胞内合成凝血因子F2、F7、F9、F10,从而发挥抗 凝作用。体内环氧型维生素K被还原为氨酿型维生素K，并由维生素环氧化物还原酶复合 体（VKORC)完成华法林抑制该酶的产生。VKORCl基因突变导致其对华法林的敏感性发生变 化，VK0RC1-1639AA(1173TT)基因型患者需要的华法林剂量显著低于-1639GA或GG(1173TC 或CC)。 华法林是一种双香豆素衍生物，是目前临床上应用最广泛的口服抗凝药物之一， 用于预防和治疗深静脉血栓、肺栓塞、屯、脏瓣膜置换术及房颤导致的血栓形成。华法林治疗 窗较窄，很小的剂量都可能导致不良反应的发生，且在不同个体达到相同作用效果，高低剂 量者之间可相差10倍W上。美国食品药品监督管理局（抑A)明确指出：在使用华法林时， 建议检测VKORCl基因型。 焦憐酸测序（Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序（即，确定DNA 中核巧酸的顺序）方法，属于新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分 析的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶 催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若 该dNTP与模板配对，聚合酶就可W将其渗入到引物链中并释放出等摩尔数的焦憐酸基团 (PPi),PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度 与反应中渗入的核巧酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分 析出峰值的情况，达到测定DNA序列的目的。不过，现有技术中还没有利用焦憐酸测序技术 检测VKORCl基因分型的产品。目前，在现有技术中，尤其是在医院内，采用有"金标准"之称的PCR-直接测序法 对VKORCl基因进行检测，但该方法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20%W 上的肿瘤组织及外周血，对于突变细胞比率小于10%的肿瘤组织及外周血，常规PCR-直接 测序法几乎无能为力；此外，该方法还存在成本高、检测周期长及操作繁琐的缺点。
技术实现思路
为了解决上述方法检测VKORCl基因分型过程中存在敏感性不高、检测周期长、操 作繁琐及成本高的技术问题，本专利技术提供一种敏感性高、特异性强、检测周期短、操作简单 并有效满足临床检验要求的焦憐酸测序法检测VKORCl基因分型的引物对及试剂盒。 本专利技术提供了一种焦憐酸测序法检测VKORCl基因分型的引物对，所述VKORCl基 因检测的多态性位点为VKORClG1639A和/或VKORClCl173T，所述引物对包括： (1)对于VKORClG1639A等位基因， 扩增引物为： VKORClG1639A正向扩增引物： 5' -CCAGAAGGGTAGGTGCAACAGT-3'(沈QIDNO. 1);[001引VKORClG1639A反向扩增引物： 5' -TGTTGGCCAGGCTTGTCTTMA-3,（沈QIDNO. 2);VKORClG1639A测序引物：5, -GCGTGAGCCACCGCA-3'（SEQIDNO. 3); 其中，所述VKORClG1639A正向扩增引物的5'端进行生物素标记； (2)对于VKORClCl173T等位基因，[001引扩增引物为：VKORClC1173T正向扩增引物： 5, -AAAGCAGGGCCTACGGAGTAGC-3,（沈QIDNO. 4); VKORClC1173T反向扩增引物： 5, -CCCCGACCTCCCATCCTAGT-3,（沈QIDNO. 5);VKORClC1173T测序引物：5, -CCAGGAGATCATCGAC-3,（SEQIDNO. 6); 其中，所述VKORClC1173T反向扩增引物的5'端进行生物素标记。本专利技术还提供了一种焦憐酸测序法检测VKORCl基因分型的试剂盒，所述VKORCl基因检测的多态性位点为VKORClG1639A和/或VKORClCl173T，所述试剂盒包括： (1)对于VKORClG1639A等位基因，VKORClG1639A正向扩增引物： 5, -CCAGAAGGGTAGGTGCAACAGT-3,；PCR反应液1，所述PCR反应液1含有VKORClG1639A反向扩增引物： 5' -TGTTGGCCAGGCTTGTCTTAAA-3';VKORClG1639A测序引物：5, -GCGTGAGCCACCGCA-3,；[003。 其中，所述VKORClG1639A正向扩增引物的5'端进行生物素标记； (2)对于VKORClCl173T等位基因，VKORClC1173T反向扩增引物： 5' -CCCCGACCTCCCATCCTAGT-3,；[003引 PCR反应液2,所述PCR反应液2含有VKORClCl173T正向扩增引物： 5' -AAAGCAGGGCCTACGGAGTAGC-3'；VKORClC1173T测序引物：5' -CCAGGAGATCATCGAC-3,； 其中，所述VKORClC1173T反向扩增引物的5'端进行生物素标记。 在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：VKORClG1639A阳性对照品1，其为插有沈QIDNO. 8所示核巧酸序列的VKORCl G1639A野生纯合子质粒；VKORClG1639A阳性对照品2,其为所述VKORClG1639A野生纯合子质粒与插有 SEQIDNO. 9所示核巧酸序列的VKORClG1639A突变纯合子质粒组成的质粒混合物；VKORClG1639A阳性对照品3,其为插有沈QIDNO. 9所示核巧酸序列的 VK0RC1G1639A突变纯合子质粒；[004引VKORClC1173T阳性对照品1，其为插有沈QIDNO. 10所示核巧酸序列的VKORCl C1173T野生纯合子质粒；VKORClC1173T阳性对照品2,其为所述VKORClC1173T野生纯合子质粒与插有 SEQIDNO. 11所示核巧酸序列的V本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种焦磷酸测序法检测VKORC1基因分型的引物对，其特征在于，所述VKORC1基因检测的多态性位点为VKORC1 G1639A和/或VKORC1 C1173T，所述引物对包括：(1)对于VKORC1 G1639A等位基因，扩增引物为：VKORC1 G1639A正向扩增引物：5’‑CCAGAAGGGTAGGTGCAACAGT‑3’；VKORC1 G1639A反向扩增引物：5’‑TGTTGGCCAGGCTTGTCTTAAA‑3’；VKORC1 G1639A测序引物：5’‑GCGTGAGCCACCGCA‑3’；其中，所述VKORC1 G1639A正向扩增引物的5’端进行生物素标记；(2)对于VKORC1 C1173T等位基因，扩增引物为：VKORC1 C1173T正向扩增引物：5’‑AAAGCAGGGCCTACGGAGTAGC‑3’；VKORC1 C1173T反向扩增引物：5’‑CCCCGACCTCCCATCCTAGT‑3’；VKORC1 C1173T测序引物：5’‑CCAGGAGATCATCGAC‑3’；其中，所述VKORC1 C1173T反向扩增引物的5’端进行生物素标记。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：滕祥云，朱江，
申请(专利权)人：长沙三济生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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