本发明专利技术公开了一种利用焦磷酸测序技术检测流行性造血器官坏死病毒的引物、试剂盒和检测方法。具体地，本发明专利技术涉及一组利用焦磷酸测序技术检测流行性造血器官坏死病毒的引物，包括如序列表中SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的扩增引物对，以及如序列表中SEQ ID No.4所示的测序引物。本发明专利技术还公开含有这些引物的检测试剂盒。本发明专利技术利用焦磷酸测序技术对流行性造血器官坏死病毒进行检测，具有高通量、快速、准确的优点，可以精确的进行短DNA序列分析，测序过程耗时短，便于构建标准化操作流程。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用焦磷酸测序技术检测流行性造血器官坏死病毒的引物、试剂 盒和检测方法，属分子生物学领域。
技术介绍
流行性造血器官坏死病（Epizootie hematopoietie necrosis，EHN)是鱼的一种 全身性疾病，主要感染红鳍鲈鱼和虹鳟鱼，使其出现肝脏、脾脏和包括肾脏在内的造血组织 坏死，以至死亡的一种鱼类传染病，由流行性造血器官坏死病毒（Epizootie hematopoietie necrosis virus，EHNV)为代表的一类病毒引起。EHNV可引起红鳍鱼卢鱼高病 死率，给渔场造成重大的经济损失，并使野生群体的数量急剧下降，虹鳟鱼感染率低而死亡 率很高，因此很难从外表健康的鱼中检测到病毒。国际兽疫局(0ΙΕ)将EHNV列入必须报告的 名录，许多国家正在研究该病的检测、预防和控制方法。对该病进行精确诊断方法的研究， 是当前我国水生动物疫病防控的迫切需要。但是目前为止，EHNV检测的标准方法主要是用 细胞分离培养病毒，然后用组织病理、免疫荧光、ELISA、电镜技术和PCR等手段鉴定，抗原捕 获ELISA可以有效鉴定该病毒，但敏感性仅为60% ;PCR方法虽然灵敏，但仍会有假阳性出现 的可能;其他方法不能达到在分子水平上进行快速确证的目的。 焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，适于 对已知短序列的测序分析，无需荧光标记引物或核酸探针，无需电泳，具有分析快速、准确、 灵敏度高、经济、自动化和实时检测的特点。该方法在普通PCR的基础上，对PCR产物进行测 序，提高了检测的特异性，且给出了分子诊断的黄金标准一基因序列，减少了由于PCR敏感 性高而出现的假阳性结果，提高了检测的准确性。焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短 DNA序列分析，通量高、操作方便，便于构建标准化操作流程，因而颇受国内外研究者的欢 迎，已广泛应用于病原微生物快速鉴定。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一组利用焦磷酸测序技术检测流行性造血器官 坏死病毒的引物。 本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种利用焦磷酸测序技术检测流行性造 血器官坏死病毒的试剂盒。 本专利技术要解决的第三个技术问题是提供一种利用焦磷酸测序技术检测流行性造 血器官坏死病毒的检测方法。 为实现上述目的，本专利技术的主要原理是利用焦磷酸测序技术，通过DNA聚合酶(DNA ploymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、焚光素酶（111(^€6抑86)和双磷酸 酶(apyrase)4种酶催化待测序DNA单链和测序引物的酶级联化学发光反应，反应底物为5'-邻酰硫酸(adenosine5 'phosphosulfate，APS)和焚光素。在每一轮测序反应中，加入1种 dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷 酸基团（PPi)。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧 光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，光信号由CCD摄像机检测并由Pyrogram?反 应为峰，每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。ATP和未掺入的dNTP由双磷 酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系，然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序即可从 反应光强的信号峰中读出。 本专利技术提供了一组利用焦磷酸测序技术检测流行性造血器官坏死病毒的引物，包 括扩增引物对和测序引物： 扩增引物对:上游引物:5'-Biotin-CTCAAGACCAAGAAGGCCATAA-3'（SEQIDNo·2) 下游引物：5'-TTTTCGGACATGCTCTTCTTCA-3'（SEQ ID Νο·3) 测序引物：5'-CTTCTCGATGCAAGAGT-3'（SEQ ID Νο·4) 其中，上游引物的5'端标记生物素。 本专利技术所述的流行性造血器官坏死病毒特异性扩增引物及焦磷酸测序引物是根 据流行性造血器官坏死病毒0RF65基因的特异区域序列，通过Assay Design SW软件设计流 行性造血器官坏死病毒特异性引物序列，以扩增出特异性单一条带，再根据扩增区域中包 含的特异核苷酸序列(特异目标序列SEQ ID No.1所示)设计焦磷酸测序引物以确定流行性 造血器官坏死病毒。流彳丁性造血器官坏死病毒0RF65基因的目标序列：CCATGAGGAA ATATCTTACC CTCTCAAACT GTCTGTCG(SEQ ID No.l);其PCR扩增片段长度为 137bp。 本专利技术还提供一种利用焦磷酸测序技术检测流行性造血器官坏死病毒的试剂盒， 该试剂盒包括上述检测流行性造血器官坏死病毒的引物组，即扩增引物对和测序引物。进 一步地，该试剂盒还包括完成PCR反应和焦磷酸测序所需材料和试剂，例如DNA提取试剂(可 以按照现有技术中公开的方法自行配制，也可以使用商业化购买的试剂盒）、PCR反应试剂 (可以按照现有技术中公开的方法自行配制，也可以使用商业化购买的试剂盒）、单链模板 制备试剂，焦磷酸测序试剂(可以按照现有技术中公开的方法自行配制，也可以使用商业化 购买的试剂盒)等，上述材料和试剂可以混合包装，也可以单独包装，优选地，为单独包装。 本专利技术还提供了一种利用焦磷酸测序技术检测流行性造血器官坏死病毒的检测 方法，该方法包括： (1)提取待测样品DNA作为模板，可以使用现有技术中已知的提取方法或商业化试 剂盒进行提取； (2)使用上述扩增引物对进行PCR扩增反应； (3)若流行性造血器官坏死病毒特异PCR反应为阳性，即扩增片段为137bp，则回收 PCR扩增产物，制备焦磷酸测序单链模板，然后使用上述测序引物进行焦磷酸测序，若目的 序列与CCATGAGGAA ATATCTTACC CTCTCAAACT GTCTGTCG(SEQ ID No. 1)特异目标序列一致， 则待测样品中含有流行性造血器官坏死病毒;若流行性造血器官坏死病毒特异PCR反应为 阴性，则判定样品为非流行性造血器官坏死病毒。 本专利技术的优点是:本专利技术利用焦磷酸测序技术对流行性造血器官坏死病毒进行检 测，与现有技术相比，该技术具有高通量、快速、准确的优点，可以精确的进行短DNA序列分 析，测序过程耗时短，便于构建标准化操作流程。PCR产物可直接用于测序，不需进行产物纯 化等二次处理，操作简便，所需样品量少。 下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本专利技术作进一步说明，凡依照本专利技术公开 内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本专利技术的保护范围。【附图说明】 图1为本专利技术对流行性造血器官坏死病毒PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳结果； 其中Μ为DNA Marker，1为流行性造血器官坏死病毒，2为阴性对照。 图2为本专利技术对流行性造血器官坏死病毒PCR扩增产物进行焦磷酸测序的结果。 图3为本专利技术对样品DNA的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳的结果;其中Μ为DNA Marker，1为已确诊为流行性造血器官坏死病毒的虹鳟鱼组织样品，2为流行性造血器官坏 死病毒感染的病鱼组织样品，3为正常虹鳟鱼组织样品，4为阴性对照。图4为本专利技术对流行性造血器官坏死病毒感染的病鱼组织DNA PCR扩增产物的测 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组利用焦磷酸测序技术检测流行性造血器官坏死病毒的引物，其特征在于：包括如序列表中SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的扩增引物对，以及如序列表中SEQ ID No.4所示的测序引物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王娜，张旻，景宏丽，王彩霞，吴绍强，张利峰，江育林，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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