本发明专利技术实施例公开了一种基于目标诱导链释放和限制性内切酶酶切循环的新型信号放大技术和化学发光检测赭曲霉素A的方法。将赭曲霉素A适体(DNA1)和赭曲霉素A适体互补序列(DNA2)固定于磁珠表面，在赭曲霉素A存在时，DNA1与赭曲霉素A作用，导致DNA2从磁珠表面脱落；经过磁性分离后，将DNA2与聚合模板DNA3杂交，形成部分互补DNA双链，在DNA聚合酶Phi29的作用下，DNA2沿着模板DNA3生长，从而形成完全互补的双链DNA；生成的双链DNA的一条链被限制性内切酶Nb.BbvCI切割，从而生成一条短链DNA；被切割的DNA形成一个新的生长点，并在聚合酶Phi29和限制性内切酶Nb.BbvC的作用下，继续进行生长和切割，由于生长和切割的不断进行，从而产生大量的短链DNA；再利用DNA和化学发光试剂标记的化学发光纳米粒子为探针对该短链DNA进行测定，实现赭曲霉素A的测定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于化学发光检测
，特别涉及一种信号放大技术的研制和一种化学发光探针的制备，在其应用上涉及赭曲霉素A(Ochratoxin A, 0ΤΑ)含量的检测。
技术介绍
根据世界卫生组织(WHO)统计报告表明，食源性疾病已经成为当今世界上分布最广泛、最常见的疾病之一。食源性相关疾病的发病率居各类疾病总发病率的前列，并成为当前国际上最突出的公共卫生问题。造成食源性相关疾病的食品安全问题主要集中在生物毒素危害、化学危害、食品微生物危害、寄生虫危害等几个方面。在粮食供应中，毒素可由许多途径产生，如农业生产、工业加工以及储藏运输活动等；这些有害物质在ng/g pg/g、甚至更低的水平上对人类的身体有害。食品中霉菌毒素污染是一个特殊问题，这是由于 真菌感染的谷物豆类、水果干、花生、啤酒和葡萄汁等加工后还会存在于食品中。每年都有很多人由于食品中有害物质而感染疾病 0例如，最常见的疾病胃肠炎，其就是由于摄入受金黄色葡萄球菌肠毒素(SEs)污染的食物所引起的。赭曲霉毒素A是天然存在的霉菌衍生代谢产生的一种真菌毒素，能使人的肾脏受损、动物的产蛋率下降，并有致畸、致癌作用，而且赭曲霉毒素A还可通过母亲的血液转入到乳汁中婴儿摄取。因此，很多国家都对食品中的OTA含量都有限制。OTA检测技术已经得到长足的发展。现在OTA检测方法主要是色谱技术，包括薄层色谱(TLC)，气相色谱(GC)，高效液相色谱(HPLC)，液相色谱-质谱联用(LC-MS)，固相萃取-液相色谱-电喷雾质谱联用(SPE-LC-ESI-MS)，毛细管电泳法(CE)等。此外，固相微萃取-液相色谱-荧光检测也已经报道过了。自从Cruz-Aguado和Penner在2008年发现了具有选择性识别OTA的DNA适体后，科研人员相继研究出了一系列基于OTA适体的检测OTA的新方法。这开辟了一种 OTA 真菌毒素检测的新局面。尽管这些OTA检测方法自身有很多优势，但仍然需要寻找一些新方法来提高测定的灵敏度和选择性。提高生物传感器灵敏度的有效方法之一就是建立新的信号放大技术。一些信号放大技术如聚合酶链反应(PCR)，滚环放大(RCA)，环介导等温放大(LAMP)和限制性内切酶信号放大都已经见诸报道了。在这些方法中，限制性内切酶信号放大方法是借助切口酶为工具，以循环利用为原理，使一个待测目标物产生多个信号单元。这种切口酶的酶切循环信号放大技术在分析检测中取得了高的灵敏度，开辟了新的信号放大原理和分析测定技术，这种方法测定的灵敏度较普通方法(没有经过切口酶的酶切循环信号放大过程)提高了许多。本专利技术的目的是利用DNA聚合酶聚合作用和切口酶酶切作用原理构建以一个目标待测物产生多个信号单元的信号放大技术，以功能化的纳米粒子为标记物，实现高灵敏度对OTA行进测定。本专利技术所提供的方法包括以下步骤(I)制备功能化的纳米粒子。所述的方法，其所述的纳米粒子为表面具有活性基团的二氧化硅纳米粒子、金纳 米粒子、磁性纳米粒子、量子点、聚合物纳米粒子、脂质体以及没有活性基团的金纳米粒子。(2)利用化学发光试剂对功能化的纳米粒子进行修饰，制备化学发光纳米粒子。所述的方法，其所述的化学发光试剂为鲁米诺、鲁米诺衍生物；光泽精、洛粉碱、过氧化草酸酯类以及吖啶酯类及其衍生物。(3)利用识别作用DNA5对化学发光纳米粒子进行修饰，得化学发光纳米粒子探针。(4)利用适体DNAl和互补DNA2对磁性微珠进行修饰制备功能化的磁性微珠(FMBl)。(5)利用DNA4对磁性微珠进行修饰制备另外一种用于捕获后续DNA的功能化的磁性微珠FMB2。(6)利用OTA与适体DNAl的作用，将(4)中制备的功能化磁性微珠表面的DNA2置换下来，释放DNA2 ;将释放出的DNA2与模板DNA3反应，生成部分互补的双链，在DNA聚合酶和切割酶的作用下，实现生长于切割的循环，生成大量的短链DNA。(7)所述的方法，其所述的对短链DNA产生作用的酶为聚合酶Phi29，进行切割的酶为限制性内切酶Nb. BbvCI。(8)以化学发光纳米粒子为探针，利用功能化磁性微珠表面DNA3捕获作用连接(6)生成的短链DNA，引起功能化磁性微珠表面化学发光试剂浓度的变化。(9)化学发光检测。将(8)中捕获有化学发光探针的磁性微珠进行化学发光测定，据此实现对OTA的检测。附图说明图I为本专利技术的实验原理示意图。图2不同目标物的检测结果图。图3为化学发光强度与OTA浓度的标准曲线图。具体实施例方式下面的实例将具体说明本专利技术的操作方法，但本专利技术的实施方法不限于此。I本专利技术所用的试剂4-氧-4-氨基]-2-丁酸(OTSPAB)从上海信达化学工业有限公司(上海，中国)购进。四乙氧基硅烷(TEOS)，正己醇，曲拉通X-100 (TX-100)和环己烷都是从上海化工厂购进(上海，中国)。N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和I-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)是从Sigma (St. Louis, USA)购进的。N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)是从 Tokyo Chemical Industry Co. Ltd. (Tokyo, Japan)买进的。DNA聚合酶Phi29(10Ul·! L—1)(包含Phi29聚合酶反应缓冲溶液)和三磷酸脱氧单核苷酸混合溶液(dNTPs) (IOmM)和 Nb. BbvCI (10U μ Γ1)(包含缓冲液 2)都是从 New England BiolabsCo. Ltd. (Ipswich,MA, USA)买进。OTA 是从 Sigma-Aldrich (USA)购进。(注意:0ΤΑ 是一种具有很强的致癌作用的药品，因此特别注意的是尽量避免与它接触。受污染的OTA原料，赭曲霉毒素和法华林必须妥善处理。)轻基化磁性微珠(MBl) (I μ m-1. 5 μ m, IOmg ml/1)和轻基化磁性微珠(MB2) (100-200nm, 5mg mL—1)是从天津贝思乐色谱技术开发中心买进的(天津，中国)。所有的试剂都是分析纯并且使用前不需要进一步进行纯化。结合缓冲液(BB)(IOmM Tris, pH8. 5,120mM NaCl，5mM KCl，和 20mM CaCl2)用于在适体和 OTA 之间的结合反应。2本专利技术所用的DNA由赛百盛基因技术有限公司(北京，中国)合成，序列如下 2. I DNAl 5/ -NH2-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3'2. 2 DNA2 5/ -CAC CCA CAC CCG ATC-3'2. 3 DNA3 5'-ACT CCC CGG ATT CCTCAGC GAT CGG GTG TGG GTG-3'2.4 DNA4 :5'-NH2_AAC TTA ACT CCC CGG-3'2. 5 DNA5 :5'-ATT CCT CAG AGG TAC-3'。3化学发光纳米粒子探针的制备3. I功能化二氧化硅纳米粒子的合成。将I. 77mL表面活性剂TX-100，7. 5mL环己烧和I. 8mL助表面活性剂正己醇用磁力搅拌器混合30min.。然后，加入0. 48mL水，并持续搅拌至混合物形成均匀的油包本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于目标诱导链释放和限制性内切酶酶切循环的信号放大技术建立及其在赭曲霉素A超灵敏度检测中的应用，其特征包括以下步骤：(a)首先，将适体和适体互补序列固定在磁珠表面，在有目标物存在时，适体互补序列从磁珠表面脱落。经磁性分离后，将适体互补序列与模版DNA杂交，在DNA聚合酶的作用下，适体互补序列会沿着模版生长，形成完全互补双链DNA。(b)将步骤(a)的生成的双链DNA用切割酶切割，得到一条短链DNA，同时得到新的生长位点，在聚合酶酶和切割酶的作用下，生长和切割会不断进行产生大量短链DNA。(c)将(b)所得短链DNA用化学发光探针进行测定，从而实现对目标物的检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：混旭，刘芳，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：
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