使用珠分离高分子量DNA的试剂盒制造技术

本实用新型专利技术涉及使用珠分离高分子量DNA的试剂盒。所述试剂盒包括一个或多个最小尺寸为至少200μm的珠；和具有一个或多个出口开口的珠保持管，其中每个出口开口的大小小于一个或多个珠的最小尺寸，并且其中珠保持管包括：(i)至少一个脊，用于将一个或多个珠支撑在一个或多个出口开口上方，从而使一个或多个出口开口保持不被一个或多个珠子阻塞；或(ii)以网格排列的一系列出口开口，和任选地，用于接收含有珠的管的收集管。该试剂盒用于以使用一个或多个珠从细胞裂解物中吸附DNA的快速可复制的方式分离具有预期长度的高分子量(HMW)DNA。

【技术实现步骤摘要】
使用珠分离高分子量DNA的试剂盒
本技术涉及使用珠分离高分子量DNA的试剂盒
技术介绍
存在数种分析长核酸分子的方法。例如，常规地使用纳米孔测序来对长度为数十至数百的千碱基的DNA分子进行测序(参见例如，OxfordNanoporeTechnologies，牛津英国)。一项纳米孔测序研究报告了超过两兆碱基(Mb)的读长长度(Payne等人，Bioinformatics.201935：2193-2198)。同样，PacBio平台(PacificBioscience，MeloPark,加利福尼亚州)能够对长度为几十的千碱基的核酸分子进行测序。其他基因组映射平台，例如基于纳米通道阵列的方法(在Lam等人，Nat.Biotechnology201230：771-776中描述，由加利福尼亚州圣地亚哥的BioNanoGenomics公司开发)也提供了分析长核酸分子的方法。如上所述的长范围基因组分析方法需要纯化的高分子量(HMW)DNA作为进样。传统上，HMW基因组DNA(gDNA)是通过苯酚/氯仿提取和随后的乙醇沉淀同时将gDNA绕在玻璃棒上而从细胞中纯化出来的。有数种从小体积样品中纯化HMWgDNA的方法。这些包括磁盘、磁珠和二氧化硅过滤器。但是，每种现有方法都有一定的缺陷。一些方法导致HMWDNA的剪切。其他方法需要多个处理步骤，因此不理想适合同时处理大量样品。随着用于HMW基因组分析的方法改进以及临床、诊断和研究样品的数量的增加，仍然需要提高HMWDNA纯化的可靠性和效率。
技术实现思路
此外，本文提供了一种利用组合物的方法，该组合物包括：(i)一个或多个珠，例如玻璃珠，例如1-50个珠，其中每个珠的最小尺寸为至少200微米(μm)，优选地大于200μm，例如至少1mm，例如在1mm至6mm的范围内(例如约4mm)；(ii)包括HMWDNA的DNA溶液，例如HMWDNA的中值大小为至少35千碱基(kb)，例如至少50Kb；(iii)DNA沉淀剂。在一些实施方式中，一个或多个珠基本山是圆形的并且最小尺寸对应于珠的直径。在一些实施方式中，在用于珠保持管的单个试剂盒或组合物中，珠大小可以变化，尽管在任何单个珠保持管中使用相同或紧密相似尺寸的珠可能是优选的。方法可以包括以下步骤中的至少一步：温育组合物以将DNA粘附到一个或多个珠上；从一个或多个珠上去除未结合的材料；用洗涤缓冲液洗涤一个或多个珠；将DNA从一个或多个珠上释放到洗脱缓冲液中；和将洗脱物中已释放的DNA与一个或多个珠分离。DNA溶液可以是预纯化的HMWDNA或包括HMWDNA和大分子的复杂混合物，例如细胞裂解物。DNA溶液可以通过裂解细胞产生裂解物，离心裂解物并将上清液用作DNA溶液而产生。可选地，DNA溶液可以通过裂解细胞产生裂解物并将裂解物用作DNA溶液而产生。可选地，DNA溶液可以是通过在裂解缓冲液中以300rpm-2000rpm范围内的搅拌速率搅拌细胞而产生的裂解物。搅拌可能发生在至少37℃-56℃的温度下。搅拌速度决定了DNA溶液中所用DNA的中值长度。方法中使用的DNA沉淀剂可以包括离液盐、群集剂(例如聚乙二醇(PEG))和/或醇(例如乙醇或异丙醇)。离液盐和/或群集剂可以以高浓度存在于DNA沉淀剂中。未结合的材料的去除可以通过倾倒或移液来实现，其中移液利用例如大口径的移液管吸头。可以包括使用含醇的洗涤缓冲液的洗涤步骤。洗涤步骤可以从粘附到珠的DNA中去除残留的材料。洗涤步骤可通过在含醇的洗涤缓冲液中洗涤珠，将珠倒入珠保持管中并旋转珠保持管以除去上清液而留下粘附在珠上的DNA来完成。通过用合适的洗脱缓冲液洗涤DNA珠，可以将DNA从珠释放到洗脱物中。可以在珠保持管中将DNA珠和洗脱缓冲液合并，将其离心以允许在收集管或外管中收集洗脱物，而珠则保留在珠保持管中。在一个实例中，在离心之前将珠保持管插入收集管中。在这种构造中，珠保持管具有一个或多个出口开口，其中这些开口的大小小于一个或多个珠的最小尺寸。一个或多个出口开口可以是基本上圆形形状，并且直径小于一个或多个珠的最小尺寸。一个以上的出口开口优选地具有至少0.5mm的大小(例如直径)。珠保持管被设计成使得一个或多个珠不阻塞一个或多个出口开口，从而允许包含珠的洗脱物从含珠的管流出进入收集管。这可以通过包括一个或多个脊、凸缘或套环的珠保持管来实现，所述脊、凸缘或套环在管中的一个或多个出口开口上方支撑一个或多个珠。在一个实施方式中，出口开口为筛子或多孔网的形式，包括以网格图案布置的一系列出口开口。可选地，可将珠和DNA洗脱缓冲液包含在密闭管中，并通过将上清液倒入或吸移到收集管中来除去含DNA的洗脱缓冲液。释放的DNA是高分子量(HMW)DNA，例如其中值大小为至少25kb，例如至少35kb-50kb。还提供了组合物，其包括：一个或多个最小尺寸为200μm的珠子(例如玻璃珠)；包含HMWDNA的DNA溶液，该HMWDNA的中值大小为至少35kb或至少50kb；和DNA沉淀剂，其中该沉淀剂可以包括在本领域中通常使用的高浓度的醇、和/或离液盐或群集剂。在一些实施方式中，一个或多个珠的最小尺寸为至少200μm，例如至少1mm，例如在1mm至6mm的范围内(例如约4mm)。一个或多个珠可以例如基本上是球形的，并且直径为至少200μm，例如至少1mm，例如在1mm-6mm的范围内(例如约4mm)。在一些实施方式中，一个或多个珠是1-50个珠，例如1-50个球形玻璃珠。DNA溶液可以得自细胞裂解物，或者可以是细胞裂解物或组织裂解物，或者得自预先用其他方法纯化的HMWDNA。当DNA沉淀剂是醇时，该醇可以是乙醇或异丙醇。包括一个或多个珠、DNA溶液和DNA沉淀剂的组合物可以包含在珠保持管中，其中DNA粘附在珠上。还提供了试剂盒，其包括：(a)一个或多个最小尺寸为至少200μm的珠(例如玻璃珠)；和(b)珠保持管，其具有用于接收DNA溶液的开口和一个或多个出口开口，其中每个出口开口的大小小于每个珠的最小尺寸，其中对于最小尺寸大于500μm的珠，出口开口优选为至少为500μm。珠保持管被设计成使得一个或多个出口开口不被一个或多个珠阻塞。如图4A所示，这可以通过在出口开口周围具有一个或多个脊、凸缘或套环而实现，当流体绕着珠流动并随后从离开管时，珠可位于一个或多个脊、凸缘或套环上。在一些试剂盒中，最小尺寸为至少200μm的一个或多个珠是最小尺寸为至少1mm，例如在1mm至6mm范围内(例如约4mm)的珠。一些试剂盒可进一步包括外部收集管，其中珠保持管装配到收集管中。试剂盒中使用的珠可以由具有带电表面并且优选为光滑的材料形成，尽管表面可以是粗糙的，只要它不破坏吸附的DNA。在一个实例中，试剂盒中的珠由玻璃或陶瓷材料制成。珠可以具有任何期望的形状。在一个实例中，一个或多个珠是基本上球形的，并且直径为至少200μm，任选地至少1mm，例如在1mm至6mm的范围内(例如约4mm)。例如，珠可以是一个或多个球形玻璃或陶瓷珠。一个或多个珠子可以是1-50个珠，例如其中在每个珠保持管中可包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种试剂盒，其包括：/n(a)一个或多个最小尺寸为至少200μm的珠；和/n(b)珠保持管，其具有用于接收DNA制剂的开口和一个或多个出口开口，其中每个出口开口的大小小于所述一个或多个珠的最小尺寸，并且其中所述珠保持管包括：/n(i)至少一个脊，用于将所述一个或多个珠支撑在所述一个或多个出口开口上方，以使所述一个或多个出口开口不被所述一个或多个珠阻塞；或/n(ii)以网格排列的一系列出口开口。/n

【技术特征摘要】
20190821 US 62/889,753;20190822 US 16/547,8441.一种试剂盒，其包括：
(a)一个或多个最小尺寸为至少200μm的珠；和
(b)珠保持管，其具有用于接收DNA制剂的开口和一个或多个出口开口，其中每个出口开口的大小小于所述一个或多个珠的最小尺寸，并且其中所述珠保持管包括：
(i)至少一个脊，用于将所述一个或多个珠支撑在所述一个或多个出口开口上方，以使所述一个或多个出口开口不被所述一个或多个珠阻塞；或
(ii)以网格排列的一系列出口开口。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述一个或多个珠的最小尺寸为至少1mm。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述一个或多个珠的最小尺寸在1mm至6mm的范围内。


4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述一个或多个珠由具有表面电荷的粗糙或光滑的材料形成；和/或其中所述一个或多个珠由玻璃形成或为陶瓷珠。


5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述一个或多个珠是一个或多个球形珠。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述一个或多个珠的直径为至少200μm。


7.根据权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·A·科特西尔，B·W·塔伦，E·J·坎托，
申请(专利权)人：新英格兰生物实验室公司，
类型：新型
国别省市：美国;US