酶促RNA加帽方法技术

本文提供了在体外有效地对RNA加帽的方法。在一些实施方式中，可使用痘苗加帽酶或其变体在高温下进行加帽反应。在其它实施方式中，加帽反应可包括来自阿米巴的巨大病毒，例如浮病病毒(Faustovirus)、拟菌病毒或姆姆病毒(moumouvirus)的加帽酶、或其变体。还提供了用于实践所述方法的组合物和试剂盒。用于实践所述方法的组合物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】酶促RNA加帽方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年8月23日提交的美国临时申请号62/890,821(在此通过引用以其全部并入本申请中)的优先权。

技术介绍

[0003]向未加帽的合成RNA中加入帽对于许多真核细胞中蛋白质的有效表达是重要的。此外，未加帽的RNA(至少具有5
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三磷酸的RNA)据报道激活先天免疫反应(Pichlmair等,Science 2006 314:997
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1001；Diamond等,Cytokine&Growth Factor Reviews,2014 25:543
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550)。因此，在许多治疗应用(例如，蛋白质替代疗法以及预防性或治疗性疫苗接种)中向合成RNA添加帽是非常理想的。
[0004]目前，有两种方法被用来对RNA加帽。在第一种方法中，使用RNA加帽酶将合成的RNA(例如，体外转录的RNA)转变为加帽的RNA。在另一种方法(通常被称为“共转录加帽”)中，将诸如反转录帽类似物(ARCA)的帽类似物和加帽的二核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.在体外对RNA加帽的方法，包括：使(i)包含未加帽的目标RNA的RNA样品；(ii)包含与SEQ ID NO:1、7或20至少90％同一性的氨基酸序列的RNA加帽酶；(iii)鸟苷三磷酸(GTP)或修饰的GTP(iv)缓冲剂；和(v)甲基供体，在40℃
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60℃的温度下接触以形成加帽的目标RNA。2.在体外有效地对RNA加帽的方法，包括：使(i)包含未加帽的目标RNA的RNA样品；(ii)具有RNA三磷酸酯酶(TPase)、鸟苷酸转移酶(GTase)和鸟嘌呤
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N7甲基转移酶(N7 MTase)活性的单链RNA加帽酶；(iii)鸟苷三磷酸(GTP)或修饰的GTP(iv)缓冲剂；和(v)甲基供体，在37℃
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60℃的温度下接触以形成加帽的目标RNA。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述未加帽的RNA目标在长度上是至少200nt。4.权利要求1或2或3所述的方法，其中接触进一步包括将所述温度升高或降低至37℃
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60℃的第二温度，其中所述第二温度不同于所述第一温度。5.权利要求2所述的方法，其中所述单链RNA加帽酶包含：(a)与(x)SEQ ID NO:2、(y)SEQ ID NO:3、和/或(z)SEQ ID NO:4至少90％同一性的氨基酸序列，或(b)与(x)SEQ ID NO:5和/或(y)SEQ ID NO:6至少90％同一性的氨基酸序列。6.权利要求2所述的方法，其中所述单链RNA加帽酶包含与(a)SEQ ID NO:7、(b)SEQ ID NO:8、(c)SEQ ID NO:9、(d)SEQ ID NO:10、(e)SEQ ID NO:11或(f)SEQ ID NO:12至少90％同一性的氨基酸序列。7.任一项前述权利要求所述的方法，其中(i)、(ii)、(iii)、和(iv)不含RNase，并且接触任选地进一步包括接触(v)一种或多种RNase抑制剂。8.任一项前述权利要求所述的方法，进一步包括利用固相寡核苷酸合成化学合成所述未加帽的RNA。9.任一项前述权利要求所述的方法，进一步包括通过使编码所述未加帽的RNA的DNA模板与聚合酶接触合成所述未加帽的RNA来产生所述未加帽的RNA。10.任一项前述权利要求所述的方法，其中所述甲基供体是S
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腺苷甲硫氨酸，并且接触进一步包括接触(vi)帽2
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O甲基转移酶。11.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述未加帽的目标RNA包含一种或多种假尿苷。12.任一项前述权利要求所述的方法，其中接触进一步包括在单个位置使(i)、(ii)、(iii)、(iv)和任选地(v)接触。
13.组合物，包含：(i)未加帽的目标RNA；(ii)具有RNA三磷酸酯酶(TPase)、鸟苷酸转移酶(GTase)和鸟嘌呤
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N7甲基转移酶(N7 MTase)活性的单链RNA加帽酶；(iii)鸟苷三磷酸(GTP)；(iv)缓冲剂；和(v)甲基供体。14.权利要求13所述的组合物，其中所述组合物具有在37℃
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60℃范围内的温度。15.权利要求12所述的组合物，其中所述组合物不...

【专利技术属性】
技术研发人员：G，
申请(专利权)人：新英格兰生物实验室公司，
类型：发明
国别省市：