用于数字聚合酶链反应的组合物和方法技术

在一些方面，本公开提供了用于鉴定核酸样品中的序列变体的方法。在一些实施方案中，方法包括区分多核苷酸中的真正突变与在扩增步骤过程中引入的随机错误。在一些实施方案中，该方法减少由数字PCR测定报告的假阳性的数目。在一些实施方案中，该方法提高数字PCR测定的准确性。的准确性。的准确性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于数字聚合酶链反应的组合物和方法
交叉引用
[0001]本申请要求2018年7月5日提交的第62/694,324号美国临时申请的权益，该美国临时申请通过引用整体并入本文。

技术介绍

[0002]数字聚合酶链反应(PCR)是对传统聚合酶链反应方法的改进，其允许用户直接对样品中的核酸进行定量。数字PCR方法通常包括将样品分配到多个离散的分区中，使得每个分区可以被单独探询。数字PCR非常灵敏，但是由于可以在一个反应中测定的通路(plex)有限，因此可能难以规模化。对于使用无细胞DNA(cfDNA)作为输入的液体活检，该问题可能更成问题，因为起始材料通常很少。解决此问题的一种方法可能是在进行数字PCR之前扩增cfDNA，以便提供足够的起始材料以分成不同的测定。然而，在扩增步骤过程中引入的错误可通过数字PCR产生假阳性。这对于低等位基因频率变体检测可能具有挑战性。因此，本文提供了用于对具有少量核酸的样品进行数字聚合酶链反应的组合物和方法。所述组合物和方法可以通过减少假阳性判定的数目来提供对数字PCR技术的改进。

技术实现思路

[0003]在一方面本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种鉴定包含多个多核苷酸的核酸样品中的序列变体的方法，所述方法包括：(a)使所述多个多核苷酸环化以形成多个环化的多核苷酸；(b)扩增所述多个环化的多核苷酸以生成多个多联体，每个多联体包含多个序列重复；(c)将所述多个多联体分配到多个分区中，使得单独分区中存在平均不超过一个包含靶序列的多联体，其中所述多个分区中的单独分区含有第一探针和第二探针中的至少一个，其中所述第一探针与缺乏所述序列变体的所述靶序列结合并产生第一信号，并且所述第二探针与含有所述序列变体的所述靶序列结合并产生第二信号；(d)检测来自所述单独分区的所述第一信号和所述第二信号；以及(e)仅当所述第二信号的水平超过指示靶序列的一个拷贝的阈值水平并且所述第一信号的水平低于指示靶序列的一个拷贝的阈值水平时，将所述序列变体鉴定为存在于所述靶序列中。2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括，当所述第一信号的水平超过指示靶序列的一个拷贝的阈值水平并且所述第二信号的水平低于指示靶序列的一个拷贝的阈值水平时，将所述序列变体鉴定为不存在。3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括，当所述第一信号的水平超过指示靶序列的一个拷贝的阈值水平并且所述第二信号的水平超过指示靶序列的一个拷贝的阈值水平时，鉴定为假阳性。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其进一步包括基于所述鉴定来输出结果。5.根据权利要求4所述的方法，其中从所述结果中忽略假阳性。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中所述多个多核苷酸包含单链多核苷酸。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中所述多个多核苷酸包含无细胞DNA。8.根据权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中所述环化包括将所述多个多核苷酸中的至少一个多核苷酸的5
’
端和3
’
端连接。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的方法，其中所述环化包括将衔接子连接至所述多个多核苷酸中的至少一个多核苷酸的5
’
端、3
’
端或5
’
端和3
’
端两者。10.根据权利要求1
‑
9中任一项所述的方法，其中所述扩增包括使用具有链置换活性的聚合酶进行扩增。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的方法，其中所述扩增包括使用滚环扩增来扩增所述多个环化的多核苷酸。12.根据权利要求1
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11中任一项所述的方法，其中所述扩增包括使所述多个环状多核苷酸经受包含随机引物的扩增反应混合物。13.根据权利要求1
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11中任一项所述的方法，其中所述扩增包括使所述多个环状多核苷酸经受包含一种或多种引物的扩增反应混合物，每种引物通过序列互补性与不同的靶序列特异性杂交。14.根据权利要求1
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13中任一项所述的方法，其中所述多个多联体在所述分配之前不富集。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的方法，其进一步包括，在所述分配之前，对所述多个多联体进行片段化以生成多个片段化的多联体。
16.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括，在所述片段化之后且在所述分配之前，基于大小选择多个所述片段化的多联体。17.根据权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中所述多个分区包含基于乳液的小液滴。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述基于乳液的小液滴包含皮升或纳升大小的小液滴。19.根据权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中所述多个分区包含孔或管。20.根据权利要求1
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19中任一项所述的方法，其中所述第一探针包含第一可检测标记，并且所述第二探针包含第二可检测标记。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述第一可检测标记包含第一荧光标记，并且所述第二可检测标记包含第二荧光标记。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第一荧光标记和所述第二荧光标记的发射光谱不同。23.根据权利要求1
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22中任一项所述的方法，其中所述检测进一步包括测量所述第一信号和所述第二信号的强度。24.根据权利要求1
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23中任一项所述的方法，其中所述序列变体是单核苷酸多态性。25.根据权利要求1
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24中任一项所述的方法，其中所述第一探针和所述第二探针是基于Taqman测定的探针。26.根据权利要求25所述的方法，其进一步包括，在所述分配之后且在所述检测之前，对所述多联体进行聚合酶链反应，以扩增所述多个序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁莉，马利克，
申请(专利权)人：安可济控股有限公司，
类型：发明
国别省市：