用于形成连接产物的方法和组合物技术

在一些方面，本公开提供了无需富集单链多核苷酸而形成包含单链多核苷酸的连接产物的方法。通过本公开的各个方面形成的连接产物可用于多种应用，包括但不限于序列分析。在一些实施方案中，所述连接产物包含无细胞多核苷酸。在一些方面，本公开提供了与本文方法一致的反应混合物、试剂盒和复合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于形成连接产物的方法和组合物交叉引用本申请要求2018年6月12日提交的第62/684,057号美国临时申请的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。
技术介绍
形成多核苷酸连接产物可具有多种用途，如检查靶多核苷酸、用来生成表达载体的分子克隆方法、cDNA文库构建以及作为扩增和测序反应的前置步骤。在许多情况下，用于分析、分子克隆和其他过程的靶多核苷酸存在于包含多核苷酸的不均匀混合物的核酸样品中。选择性形成包含在多核苷酸的不均匀混合物中存在的靶多核苷酸的连接产物可能是优选的。然而，缺乏进行选择性形成连接产物的有效方法，例如对于包含随机片段DNA如无细胞DNA的靶多核苷酸而言。现有的选择性形成连接产物的方法可能具有效率低、产率低和工作流程繁琐的缺点。
技术实现思路
鉴于上述情况，对利用单链多核苷酸靶标生成连接产物的改进方法存在需求。本公开的方法和组合物满足了这一需求，并且还提供了额外的益处。在一个方面，本公开提供了一种形成包含单链样品多核苷酸的连接产物的方法，其中所述单链样品多核苷酸包含在靶多核苷酸的5’端与第一延伸序列接合并在靶多核苷酸的3’端与第二延伸序列接合的靶多核苷酸，所述方法包括：(a)将所述单链样品多核苷酸、第一单链衔接子、第二单链衔接子、第一桥联探针和第二桥联探针混合以形成多核苷酸复合物，其中所述多核苷酸复合物包括(i)通过序列互补性与第一单链衔接子的3’端特异性杂交的第一桥联探针的5’端，和通过序列互补性与第一桥联探针的3’端特异性杂交的单链样品多核苷酸的5’端，以及(ii)通过序列互补性与所述单链样品多核苷酸的3’端特异性杂交的第二桥联探针的5’端，和通过序列互补性与第二桥联探针的3’端特异性杂交的第二单链衔接子的5’端；(b)(i)将第一单链衔接子的3’端连接至所述单链样品多核苷酸的5’端，并且(ii)将所述单链样品多核苷酸的3’端连接至第二单链衔接子的5’端；以及(c)降解或选择性地去除所述第一和第二桥联探针，从而形成连接产物。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸包含无细胞DNA。在一些实施方案中，所述无细胞DNA包含序列变体。在一些实施方案中，所述序列变体包括单核苷酸多态性、单核苷酸变体、插入、缺失、重复、倒位、易位、拷贝数变异、基因融合和指示甲基化的突变中的至少一种。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸包含具有至少一个拷贝的无细胞DNA序列或其互补序列的线性多联体。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸包含基因组DNA或其片段。在一些实施方案中，所述第一桥联探针在所述单链样品多核苷酸的5’端与所述第一延伸序列的至少一部分杂交。在一些实施方案中，所述第一桥联探针在所述单链样品多核苷酸的5’端与所述第一延伸序列和所述靶多核苷酸的至少一部分杂交。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸的5’端的区段不与所述第一桥联探针特异性杂交，并且所述区段形成第一单链环。在一些实施方案中，在(b)中的连接之前，将所述第一单链环切除。在一些情况下，不切除该环。在一些实施方案中，所述第一桥联探针的区段不与所述靶多核苷酸的5’端特异性杂交，并且所述区段在所述多核苷酸复合物中形成第一单链环。在一些实施方案中，所述第二桥联探针在所述单链样品多核苷酸的3’端与所述第二延伸序列的至少一部分杂交。在一些实施方案中，所述第二桥联探针在所述单链样品多核苷酸的3’端与所述第二延伸序列和所述靶多核苷酸的至少一部分杂交。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸的3’端的区段不与所述第二桥联探针特异性杂交，并且所述区段形成第二单链环。在一些实施方案中，在(b)中的连接之前，将所述第二单链环切除。在一些情况下，不切除该环。在一些实施方案中，所述第二桥联探针的区段不与所述靶多核苷酸的3’端特异性杂交，并且所述区段在所述多核苷酸复合物中形成第二单链环。在一些实施方案中，所述第一延伸序列包括扩增引物结合序列、测序引物结合序列、条形码序列和分子标识符序列中的至少一个。在一些实施方案中，所述第二延伸序列包括扩增引物结合序列、测序引物结合序列、条形码序列和分子标识符序列中的至少一个。在一些实施方案中，所述第一单链衔接子包含扩增引物结合序列、测序引物结合序列、条形码序列和分子标识符序列中的至少一个。在一些实施方案中，所述第二单链衔接子包含扩增引物结合序列、测序引物结合序列、条形码序列和分子标识符序列中的至少一个。在一些实施方案中，所述第一桥联探针、所述第二桥联探针或所述第一和第二桥联探针两者包含修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述第一桥联探针、所述第二桥联探针或所述第一和第二桥联探针两者包含脱氧尿苷。在一些实施方案中，包含脱氧尿苷的所述第一桥联探针、所述第二桥联探针或所述第一和第二桥联探针两者包含至少5％的脱氧尿苷。在一些实施方案中，包含脱氧尿苷的所述第一桥联探针、所述第二桥联探针或所述第一和第二桥联探针两者包含至少5个脱氧尿苷。在一些实施方案中，所述第一桥联探针、所述第二桥联探针或所述第一和第二桥联探针两者包含RNA。在一些实施方案中，在(c)中，所述第一和第二桥联探针被降解。在一些实施方案中，所述第一和第二桥联探针被酶促或化学降解。在一些实施方案中，降解包括用内切核酸酶或外切核酸酶处理。在一些实施方案中，降解包括用RNA内切核酸酶或RNA外切核酸酶处理。在一些实施方案中，降解包括用内切核酸酶处理，并且该内切核酸酶是尿嘧啶DNA糖基化酶。在一些实施方案中，降解包括用化学试剂处理。在一些实施方案中，所述化学试剂是氢氧化钠。在一个方面，本公开提供了一种在包含非靶样品多核苷酸的反应混合物中将第一单链衔接子和第二单链衔接子选择性地连接至单链靶样品多核苷酸的方法，所述单链靶样品多核苷酸包含在靶多核苷酸的5’端与第一延伸序列接合并在靶多核苷酸的3’端与第二延伸序列接合的靶多核苷酸，所述方法包括：(a)将第一单链衔接子连接至所述单链靶样品多核苷酸的5’端，其中第一桥联探针的5’端通过序列互补性与第一单链衔接子的3’端特异性杂交，并且其中第一桥联探针的3’端通过序列互补性与所述单链靶样品多核苷酸的5’端特异性杂交，其中第一桥联探针的3’端不与非靶样品多核苷酸的5’端特异性杂交，以及(b)将第二单链衔接子连接至所述单链靶样品多核苷酸的3’端，其中第二桥联探针的5’端通过序列互补性与所述单链靶样品多核苷酸的3’端特异性杂交，并且其中第二桥联探针的3’端通过序列互补性与第二单链衔接子的5’端特异性杂交，其中第二桥联探针的5’端不与非靶样品多核苷酸的3’端特异性杂交，从而将第一单链衔接子和第二单链衔接子选择性地连接至所述单链靶样品多核苷酸。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸包含无细胞DNA。在一些实施方案中，所述无细胞DNA包含序列变体。在一些实施方案中，所述序列变体包括单核苷酸多态性、单核苷酸变体、插入、缺失、重复、倒位、易位、拷贝数变异、基因融合和指示甲基化的突变中的至少一种。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸包含具有至少一个拷贝的无细胞DNA序列或其互补序列的线性多联体。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸包含基因组DNA或其片段。在一些实施方案中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种形成包含单链样品多核苷酸的连接产物的方法，其中所述单链样品多核苷酸包含在靶多核苷酸的5’端与第一延伸序列接合并在靶多核苷酸的3’端与第二延伸序列接合的靶多核苷酸，所述方法包括：/n(a)将所述单链样品多核苷酸、第一单链衔接子、第二单链衔接子、第一桥联探针和第二桥联探针混合以形成多核苷酸复合物，其中所述多核苷酸复合物包括(i)通过序列互补性与第一单链衔接子的3’端特异性杂交的第一桥联探针的5’端，和通过序列互补性与第一桥联探针的3’端特异性杂交的所述单链样品多核苷酸的5’端，以及(ii)通过序列互补性与所述单链样品多核苷酸的3’端特异性杂交的第二桥联探针的5’端，和通过序列互补性与第二桥联探针的3’端特异性杂交的第二单链衔接子的5’端；/n(b)(i)将第一单链衔接子的3’端连接至所述单链样品多核苷酸的5’端，并且(ii)将所述单链样品多核苷酸的3’端连接至第二单链衔接子的5’端；以及/n(c)降解或选择性地去除所述第一和第二桥联探针，从而形成连接产物。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180612 US 62/684,0571.一种形成包含单链样品多核苷酸的连接产物的方法，其中所述单链样品多核苷酸包含在靶多核苷酸的5’端与第一延伸序列接合并在靶多核苷酸的3’端与第二延伸序列接合的靶多核苷酸，所述方法包括：
(a)将所述单链样品多核苷酸、第一单链衔接子、第二单链衔接子、第一桥联探针和第二桥联探针混合以形成多核苷酸复合物，其中所述多核苷酸复合物包括(i)通过序列互补性与第一单链衔接子的3’端特异性杂交的第一桥联探针的5’端，和通过序列互补性与第一桥联探针的3’端特异性杂交的所述单链样品多核苷酸的5’端，以及(ii)通过序列互补性与所述单链样品多核苷酸的3’端特异性杂交的第二桥联探针的5’端，和通过序列互补性与第二桥联探针的3’端特异性杂交的第二单链衔接子的5’端；
(b)(i)将第一单链衔接子的3’端连接至所述单链样品多核苷酸的5’端，并且(ii)将所述单链样品多核苷酸的3’端连接至第二单链衔接子的5’端；以及
(c)降解或选择性地去除所述第一和第二桥联探针，从而形成连接产物。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶多核苷酸包含无细胞DNA。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述无细胞DNA包含序列变体。


4.根据权利要求3所述的方法，其中所述序列变体包括单核苷酸多态性、单核苷酸变体、插入、缺失、重复、倒位、易位、拷贝数变异、基因融合和指示甲基化的突变中的至少一种。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸包含具有至少一个拷贝的无细胞DNA序列或其互补序列的线性多联体。


6.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶多核苷酸包含基因组DNA或其片段。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述第一桥联探针在所述单链样品多核苷酸的5’端与所述第一延伸序列的至少一部分杂交。


8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一桥联探针在所述单链样品多核苷酸的5’端与所述第一延伸序列和所述靶多核苷酸的至少一部分杂交。


9.根据权利要求8所述的方法，其中所述靶多核苷酸的5’端的区段不与所述第一桥联探针特异性杂交，并且其中所述区段形成第一单链环。


10.根据权利要求9所述的方法，其中在(b)中的连接之前，将所述第一单链环切除。


11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第二桥联探针在所述单链样品多核苷酸的3’端与所述第二延伸序列的至少一部分杂交。


12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第二桥联探针在所述单链样品多核苷酸的3’端与所述第二延伸序列和所述靶多核苷酸的至少一部分杂交。


13.根据权利要求12所述的方法，其中所述靶多核苷酸的3’端的区段不与所述第二桥联探针特异性杂交，并且其中所述区段形成第二单链环。


14.根据权利要求13所述的方法，其中在(b)中的连接之前，将所述第二单链环切除。


15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一延伸序列包括扩增引物结合序列、测序引物结合序列、条形码序列和分子标识符序列中的至少一个。


16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二延伸序列包括扩增引物结合序列、测序引物结合序列、条形码序列和分子标识符序列中的至少一个。


17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一单链衔接子包含扩增引物结合序列、测序引物结合序列、条形码序列和分子标识符序列中的至少一个。


18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二单链衔接子包含扩增引物结合序列、测序引物结合序列、条形码序列和分子标识符序列中的至少一个。


19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一桥联探针、所述第二桥联探针或所述第一和第二桥联探针两者包含修饰的核苷酸。


20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一桥联探针、所述第二桥联探针或所述第一和第二桥联探针两者包含脱氧尿苷。


21.根据权利要求20所述的方法，其中包含脱氧尿苷的所述第一桥联探针、所述第二桥联探针或所述第一和第二桥联探针两者包含至少5％的脱氧尿苷。


22.根据权利要求20所述的方法，其中包含脱氧尿苷的所述第一桥联探针、所述第二桥联探针或所述第一和第二桥联探针两者包含至少5个脱氧尿苷。


23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一桥联探针、所述第二桥联探针或所述第一和第二桥联探针两者包含RNA。


24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在(c)中，所述第一和第二桥联探针被降解。


25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第一和第二桥联探针被酶促或化学降解。


26.根据权利要求25所述的方法，其中降解包括用内切核酸酶处理。


27.根据权利要求26所述的方法，其中所述内切核酸酶是尿嘧啶DNA糖基化酶。


28.根据权利要求25所述的方法，其中降解包括用化学试剂处理。


29.根据权利要求28所述的方法，其中所述化学试剂是氢氧化钠。


30.一种在包含非靶样品多核苷酸的反应混合物中将第一单链衔接子和第二单链衔接子选择性地连接至单链靶样品多核苷酸的方法，所述单链靶样品多核苷酸包含在靶多核苷酸的5’端与第一延伸序列接合并在靶多核苷酸的3’端与第二延伸序列接合的靶多核苷酸，所述方法包括：
(a)将第一单链衔接子连接至所述单链靶样品多核苷酸的5’端，其中第一桥联探针的5’端通过序列互补性与第一单链衔接子的3’端特异性杂交，并且其中第一桥联探针的3’端通过序列互补性与所述单链靶样品多核苷酸的5’端特异性杂交，其中第一桥联探针的3’端不与非靶样品多核苷酸的5’端特异性杂交，以及
(b)将第二单链衔接子连接至所述单链靶样品多核苷酸的3’端，其中第二桥联探针的5’端通过序列互补性与所述单链靶样品多核苷酸的3’端特异性杂交，并且其中第二桥联探针的3’端通过序列互补性与第二单链衔接子的5’端特异性杂交，其中第二桥联探针的5’端不与非靶样品多核苷酸的3’端特异性杂交，
从而将第一单链衔接子和第二单链衔接子选择性地连接至所述单链靶样品多核苷酸。


31.根据权利要求30所述的方法，其中所述靶多核苷酸包含无细胞DNA。


32.根据权利要求31所述的方法，其中所述无细胞DNA包含序列变体。


33.根据权利要求32所述的方法，其中所述序列变体包括单核苷酸多态性、单核苷酸变体、插入、缺失、重复、倒位、易位、拷贝数变异、基因融合和指示甲基化的突变中的至少一种。


34.根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸包含具有至少一个拷贝的无细胞DNA序列或其互补序列的线性多联体。


35.根据权利要求30所述的方法，其中所述靶多核苷酸包含基因组DNA或其片段。


36.根据权利要求30-35中任一项所述的方法，其中所述第一桥联探针在所述单链靶样品多核苷酸的5’端与所述第一延伸序列的至少一部分杂交。


37.根据权利要求36所述的方法，其中所述第一桥联探针在所述单链靶样品多核苷酸的5’端与所述第一延伸序列和所述靶多核苷酸的至少一部分杂交。


38.根据权利要求37所述的方法，其中所述靶多核苷酸的5’端的区段不与所述第一桥联探针特异性杂交，并且其中所述区段形成第一单链环。


39.根据权利要求38所述的方法，其中在(a)中的连接之前，将所述第一单链环切除。


40.根据权利要求30-39中任一项所述的方法，其中所述第二桥联探针在所述单链靶样品多核苷酸的3’端与所述第二延伸序列的至少一部分杂交。


41.根据权利要求40所述的方法，其中所述第二桥联探针在所述单链靶样品多核苷酸的3’端与所述第二延伸序列和所述靶多核苷酸的至少一部分杂交。


42.根据权利要求41所述的方法，其中所述靶多核苷酸的3’端的区段不与所述第二桥联探针特异性杂交，并且其中所述区段形成第二单链环。


43.根据权利要求42所述的方法，其中在(b)中的连接之前，将所述第二单链环切除。


44.根据权利要求30-43中任一项所述的方法，其中所述第一桥联探针、所述第二桥联探针或所述第一和第二桥联探针两者包含修饰的核苷酸。


45.根据权利要求30-44中任一项所述的方法，其中所述第一桥联探针、所述第二桥联探针或所述第一和第二桥联探针两者包含脱氧尿苷。


46.根据权利要求45所述的方法，其中包含脱氧尿苷的所述第一桥联探针、所述第二桥联探针或所述第一和第二桥联探针两者包含至少5％的脱氧尿苷。


47.根据权利要求45所述的方法，其中包含脱氧尿苷的所述第一桥联探针、所述第二桥联探针或所述第一和第二桥联探针两者包含至少5个脱氧尿苷。


48.根据权利要求30-47中任一项所述的方法，其中所述第一桥联探针、所述第二桥联探针或所述第一和第二桥联探针两者包含RNA。


49.根据权利要求30-48中任一项所述的方法，其进一步包括降解或选择性地去除所述第一和第二桥联探针。


50.根据权利要求49所述的方法，其进一步包括降解所述第一和第二桥联探针。


51.根据权利要求50所述的方法，其中所述第一和第二桥联探针被酶促或化学降解。


52.根据权利要求51所述的方法，其中所述第一和第二桥联探针被酶促降解，并且所述降解包括用内切核酸酶处理。


53.根据权利要求52所述的方法，其中所述内切核酸酶是尿嘧啶DNA糖基化酶。


54.根据权利要求50所述的方法，其中所述第一和第二桥联探针被化学降解，并且所述降解包括用化学试剂处理。


55.根据权利要求54所述的方法，其中所述化学试剂是氢氧化钠。


56.根据权利要求30-55中任一项所述的方法，其中所述第一延伸序列包括扩增引物结合序列、测序引物结合序列、条形码序列和分子标识符序列中的至少一个。


57.根据权利要求30-56中任一项所述的方法，其中所述第二延伸序列包括扩增引物结合序列、测序引物结合序列、条形码序列和分子标识符序列中的至少一个。


58.根据权利要求30-57中任一项所述的方法，其中所述第一单链衔接子包含扩增引物结合序列、测序引物结合序列、条形码序列和分子标识符序列中的至少一个。


59.根据权利要求30-58中任一项所述的方法，其中所述第二单链衔接子包含扩增引物结合序列、测序引物结合序列、条形码序列和分子标识符序列中的至少一个。

【专利技术属性】
技术研发人员：翁莉，马利克·法哈姆，
申请(专利权)人：安可济控股有限公司，
类型：发明
国别省市：开曼群岛;KY