用于富集扩增产物的方法及组合物技术

在一些方面，本公开内容提供了用于富集包含至少两个或更多个拷贝的靶多核苷酸的多联体的扩增子或扩增产物的方法。在一些实施方案中，方法包括对包含至少两个或更多个拷贝的靶多核苷酸的扩增子进行测序。在一些实施方案中，所述靶多核苷酸包含由染色体重排产生的序列，该染色体重排包括但不限于点突变、单核苷酸多态性、插入、缺失和包含融合基因的易位。在一些方面，本公开内容提供了在所述方法中有用的组合物和反应混合物。的组合物和反应混合物。的组合物和反应混合物。

Methods and compositions for enrichment of amplification products

【技术实现步骤摘要】
用于富集扩增产物的方法及组合物
本申请是申请日为2016年10月07日、申请号为201680072543.1、专利技术名称为“用于富集扩增产物的方法及组合物”的中国专利申请(其对应PCT申请的申请日为2016年10月07日、申请号为PCT/US2016/056126)的分案申请。交叉引用
[0001]本申请要求于2015年10月9日提供的美国临时申请号62/239,690的权益，该临时申请通过引用并入本文。专利技术背景
[0002]大规模平行核酸测序的出现已使得对复杂群体内的序列变异的鉴定变得可行。一种利用具有链置换能力的聚合酶的扩增方法——滚环扩增(RCA)，已作为对用于制备核酸以供测序分析的聚合酶链反应(PCR)程序的有用替代和补充而出现。RCA涉及通过将核苷酸连续添加至与环状多核苷酸模板(如环状DNA模板)退火的引物来生长具有重复序列的多核苷酸。该延伸过程可多次覆盖环状多核苷酸模板的全长，从而导致形成该模板的重复序列或者所谓的多联体。多联体也可作为模板来生成进一步的扩增产物。然而，该延伸只会进行直到达到线性多联体的末端。随着生长多核苷酸链的前端遇到DNA的双链部分，该生长链替代模板的现有链。结果通常是形成各种长度的由可变数目的模板序列重复组成的双链DNA。在常规的RCA方法中，与包含靶序列的多个重复的较长多联体相比，较短多联体经常不成比例地扩增。因此，对较长多联体的后续分析可能会更加困难。
[0003]由于常用技术的固有误差频率比群体内许多实际序列变异的频率更大，大规模平行测序具有显著的局限性。例如，在标准的高通量测序中已报道了0.1
‑
1％的误差率。当变体频率低，如等于或低于该误差率时，对罕见序列变体的检测具有高的假阳性率。
[0004]由于多种原因，检测罕见序列变体的能力非常关键。例如，检测罕见特征性序列可用于鉴定和区分有害环境污染物如细菌分类群的存在。表征细菌分类群的一种常见方法是鉴定高度保守序列如rRNA序列的差异。然而，迄今为止典型的基于测序的方法面临与给定样品中不同基因组的绝对数量和成员之间的同源性程度相关的挑战，从而为本已繁琐的程序呈现出复杂的问题。
[0005]用于检测序列变异的现有技术在检测融合基因变异和染色体重排方面特别低效。通常，与重排基因融合的
‘
配偶体
’
基因是未知的，这使得检测更具挑战性。如果没有观察到接合点，融合基因也可能难以检测。

技术实现思路

[0006]鉴于上述情况，需要检测罕见序列变异，特别是罕见序列变化和基因融合事件的替代并且/或者稳健的方法和组合物。本公开内容的组合物和方法满足了该需求，并且也提供了另外的益处。特别是，本公开内容的各个方面提供了可用于大规模平行测序方法的包含多个拷贝的靶多核苷酸的扩增子。使用包含多个拷贝的靶多核苷酸的扩增子，可不止一次对靶多核苷酸进行测序，从而减少对罕见序列变体和融合基因进行测序时的错误。
[0007]在一方面，公开了一种用于富集包含至少两个或更多个拷贝的靶多核苷酸的多联
体的扩增子的方法。该方法包括：(a)通过延伸第一引物生成包含来自环状靶多核苷酸的单链多核苷酸的多联体，该第一引物包含通过序列互补性与靶多核苷酸特异性杂交的第一3
’
端和不通过序列互补性与靶多核苷酸特异性杂交的包含第一共同序列的第一5
’
端；(b)通过延伸第二引物生成包含一个或多个拷贝的靶多核苷酸的多种延伸产物，该第二引物包含通过序列互补性与多联体特异性杂交的第二3
’
端和不通过序列互补性与多联体特异性杂交的包含第二共同序列的第二5
’
端，其中第一共同序列和第二共同序列各自在5
’
端包含至少10个连续核苷酸并且当最佳比对时至少90％相同；以及(c)在生成多个扩增子的条件下对步骤(b)的多种延伸产物进行扩增，其中富集包含至少2个或更多个拷贝的靶多核苷酸的扩增子。在一些实施方案中，步骤(a)通过具有链置换活性的聚合酶而实现。在一些实施方案中，所述第一共同序列和所述第二共同序列是相同的。在一些实施方案中，步骤(c)的扩增包括第三引物的引物延伸，其中该第三引物包含通过序列互补性与第一共同序列或第二共同序列特异性杂交的序列。在一些实施方案中，(c)的扩增步骤产生的具有两个或更多个拷贝的靶多核苷酸的扩增子的百分比大于具有少于两个拷贝的靶多核苷酸的扩增子的百分比。在一些实施方案中，具有两个或更多个拷贝的靶多核苷酸的扩增子的百分比至少为90％。在一些实施方案中，具有两个或更多个拷贝的靶多核苷酸的扩增子的百分比至少为80％。在一些实施方案中，具有两个或更多个拷贝的靶多核苷酸的扩增子的百分比至少为60％。在一些实施方案中，所述延伸产物形成茎环结构，该茎环结构包含(i)第一共同序列与第二共同序列的互补体之间的分子内杂交，或(ii)第二共同序列与第一共同序列的互补体之间的分子内杂交。在一些实施方案中，茎环产物的形成通过在退火步骤的温度保持在第三引物的解链温度
±
5℃内的情况下进行步骤(c)的扩增而实现。在一些实施方案中，茎环产物的形成通过在退火步骤保持在低于70℃的温度的情况下进行步骤(c)的扩增而实现。在一些实施方案中，该茎环结构包含至少9个碱基对的分子内杂交。在一些实施方案中，该茎环结构包含至少15个碱基对的分子内杂交。在一些实施方案中，该茎环结构包含至少20个碱基对的分子内杂交。在一些实施方案中，该茎环结构包含至少25个碱基对的分子内杂交。在一些实施方案中，该茎环结构包含至少30个碱基对的分子内杂交。在一些实施方案中，步骤(b)包括不超过6个循环的第二引物延伸。在一些实施方案中，步骤(b)包括不超过8个循环的第二引物延伸。在一些实施方案中，步骤(b)包括不超过10个循环的第二引物延伸。在一些实施方案中，所述第一共同序列、所述第二共同序列和所述第三引物的杂交序列均具有在彼此
±
5℃内的解链温度(Tm)。在一些实施方案中，该环状靶多核苷酸为环化的无细胞DNA。在一些实施方案中，该环状靶多核苷酸为基因组DNA的环化片段。在一些实施方案中，该环状靶多核苷酸包含由染色体重排产生的序列。在一些实施方案中，染色体重排是缺失、重复、倒位和易位中的至少一种。在一些实施方案中，沿靶多核苷酸从5
’
至3
’
对应于(i)与第一3
’
端互补的序列、(ii)与第二3
’
端相同的序列以及(iii)(i)与(ii)之间的间插序列的所述靶多核苷酸的序列部分的组合长度为75个或更少的核苷酸。在一些实施方案中，至少50％的多联体包含长度为至少75个核苷酸的靶多核苷酸。在一些实施方案中，环状靶多核苷酸为单链。在一些实施方案中，该方法进一步包括对步骤(c)中产生的多个扩增子进行测序。在一些实施方案中，所述测序在没有相对于包含仅一个拷贝的靶多核苷酸的扩增子选择性地纯化包含两个或更多个拷贝的靶多核苷酸的扩增子的情况下进行。在一些实施方案中，该方法进一步包括对步骤(c)中产生的多个扩增子中包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于富集包含至少两个或更多个拷贝的靶多核苷酸的多联体的扩增子的方法，所述方法包括：(a)通过延伸第一引物生成包含来自环状靶多核苷酸的单链多核苷酸的多联体，所述第一引物包含通过序列互补性与所述靶多核苷酸特异性杂交的第一3
’
端和不通过序列互补性与所述靶多核苷酸特异性杂交的包含第一共同序列的第一5
’
端；(b)通过延伸第二引物生成包含一个或多个拷贝的所述靶多核苷酸的多种延伸产物，所述第二引物包含通过序列互补性与所述多联体特异性杂交的第二3
’
端和不通过序列互补性与所述多联体特异性杂交的包含第二共同序列的第二5
’
端，其中所述第一共同序列和所述第二共同序列各自在5
’
端包含至少10个连续核苷酸并且当最佳比对时至少90％相同；以及(c)在生成多个扩增子的条件下扩增步骤(b)的所述多种延伸产物，其中富集包含至少2个或更多个拷贝的所述靶多核苷酸的扩增子。2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)通过具有链置换活性的聚合酶而实现。3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一共同序列和所述第二共同序列是相同的。4.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)的所述扩增中包括第三引物的引物延伸，其中所述第三引物包含通过序列互补性与所述第一共同序列或所述第二共同序列特异性杂交的序列。5.如权利要求1所述的方法，其中(c)的所述扩增步骤产生的具有两个或更多个拷贝的所述靶多核苷酸的扩增子的百分比大于具有少于两个拷贝的所述靶多核苷酸的扩增子的百分比。6.一种用于富集包含至少两个或更多个拷贝的靶多核苷酸的多联体的扩增子的反应混合物，所述反应混合物包含：(a)环状靶多核苷酸；(b)第一引物，其包含通过序列互补性与所述靶多核苷酸特异性杂交的第一3
’
端和不通过序列互补性与所述靶多核苷酸特异性杂交的包含第一共同序列的第一5
’
端；以及(c)第二引物，其包含通过序列互补性与所述多联体特异性杂交的第二3
’
端和不通过序列互补性与所述多联体特异性杂交的包含第二共同序列的第二5
’
端，其中所述第一共同序列和所述第二共同序列各自在5
’
端包含至少10个连续核苷酸并且当最佳比对时至少90％相同。7.一种用于富集包含至少两个或更多个拷贝的靶多核苷酸的多联体的扩增子的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)第一引物，其包含通过序列互补性与所述靶多核苷酸特异性杂交的第一3
’
端和不通过序列互补性与所述靶多核苷酸特异性杂交的包含第一共同序列的第一5
’
端；(b)第二引物，其包含通过序列互补性与所述多联体特异性杂交的第二3
’
端和不通过序列互补性与所述多联体特异性杂交的包含第二共同序列的第二5
’

【专利技术属性】
技术研发人员：翁莉，林盛榕，邓凌锋，
申请(专利权)人：安可济控股有限公司，
类型：发明
国别省市：