用于检测样本中的核酸的数位聚合酶连锁反应方法技术

本发明专利技术涉及一种检测样本中核酸(NA)分子的方法。更具体而言，本发明专利技术涉及一种用于检测特定核酸序列的改良的基于数位PCR的方法。本发明专利技术可用于研究及诊断应用，具提高的灵敏度及准确性。本发明专利技术还提供一种试剂盒，用于执行本文所述的评估样本中核酸的方法。文所述的评估样本中核酸的方法。文所述的评估样本中核酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测样本中的核酸的数位聚合酶连锁反应方法
[0001]相关申请
[0002]本申请根据美国专利法第119条(35 U.S.C.
§
119)主张于2018年10月9日提出申请的美国临时申请第62/743,149号的权益，其全部内容通过引用合并于本文。


[0003]本专利技术涉及一种检测样本中核酸(nucleic acid，NA)分子的方法。更具体而言，本专利技术涉及一种用于分析核酸片段的改良的基于数位PCR的方法。本专利技术可用于研究及诊断应用，具提高的灵敏度及准确性。本专利技术还提供一种试剂盒，用于执行本文所述的检测样本中核酸的方法。

技术介绍

[0004]已经针对许多研究及诊断应用开发了用于核酸检测的各种技术。数位聚合酶连锁反应(digital polymerase chain reaction，dPCR)被认为是分析基因复制数变异(copy number variations，CNVs)、基因表现、遗传突变及单核苷酸多型性(single
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nucleotide polymorphisms，SNPs)的最精密的定量方法之一。它的受欢迎程度不断提高。许多公司已经设计了公司特定的实验方法，硬件及软件应用程序(Dong等人，2015年；Morley，2014年；Zhao等人，2016年)。
[0005]最普遍的模型是基于液滴以及基于滴定盘的数位PCR方法。目前基于液滴的数位PCR是由Bio
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Rad公司所贩卖。QX200 Droplet Digital PCR(ddPCR)仪是Bio
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Rad公司最近贩卖的产品，是结合微流控与界面活性剂化学技术将PCR反应分为油包水液滴以进行绝对核酸定量的最先进模型之一(Hindson等人，2011年)。这种方法允许每次运行每个样本分析近20,000纳升大小的液滴，使其成为同类仪器中最有效的方法。另一方面，以Qiagen公司(http://www.captodayonline.com/high
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throughput
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digital
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pcr
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system
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1017/)为例，基于滴定盘的数位PCR在滴定盘上进行反应。对于这种方法，将DNA分子稀释并分配到例如96孔滴定盘中，以进行独立的PCR反应。扩增后，通过基因特异性序列探测并定量所有的孔，以鉴定具有阳性反应的孔。
[0006]作为基于PCR的核酸检测技术，数位PCR通常需要成对的引子进行扩增，并需要使用探针来检测目标核酸，将样本稀释并分配，以便分离其中的核酸片段以进行独立的反应，每个独立的反应具有非常有限数量的目标核酸分子。如此一来，可以在每个分区内分别进行PCR反应，并确定每个分区中的信号为阴性或阳性，因此，可以基于泊松分布(Poisson distribution)，通过对正向分区(检测到序列)与负向分区(未检测到序列)的数量进行计数，以确定原始样本中核酸序列复制的确切数量。通常，数位PCR的实验过程包括以下几个步骤：1)稀释目标DNA分子；2)将充分分离的目标DNA片段分为离散的液滴/腔室，每个液滴/腔室还包含其他用于扩增及信号检测所需的成分；3)使用针对目标基因“内部(internal)”区域的“成对(paired)”基因特异性引子进行PCR扩增；4)使用荧光探针检测荧光信号；5)基于泊松分布对阳性与阴性反应进行定量；以及6)交叉样本比较以确定显著性。
[0007]无细胞核酸样本为易于获得、非侵入性的遗传材料，在诊断多种疾病中越来越受欢迎(Wagner，2012年)。这些遗传物质从体内所有细胞释放，包括正常细胞、患病细胞以及微生物。理论上，无细胞核酸可能存在于多种体液中，包括血液、唾液、尿液、白带、精液、淋巴液以及汗液(Chiu与Yu，2019年；Nai等人，2017年；Wagner，2012年)。尽管具有许多优点，但无细胞核酸样本的数量通常很少，而造成这些样本难以操作，因此容易在实验过程中丧失。此外，无细胞核酸也会高度断裂。这些都特别显示出珍贵材料的严重问题。
[0008]现行的数位PCR在循环无细胞核酸分析方面仍然面临许多挑战。一些方法被提出来改善当前的数位PCR，例如适当保存核酸样本以减少无细胞DNA(cell
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free DNAs，cfDNAs)的降解，有效的纯化例如硅胶膜收集足够量的cfDNAs进行检测，并通过高灵敏度毛细管电泳提高检测灵敏度。现行的数位PCR还具有缺点，即基于特定的已知突变位点设计探针以检测核酸中的某些突变，但其不能涵盖所有遗传变异，因此限制了对其他潜在变异或突变的测试。
[0009]因此，需要开发用于核酸检测的改良的数位PCR方法。

技术实现思路

[0010]本专利技术提供一种用于样本中核酸检测的改良的数位PCR，称为数位T
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寡引子PCR(数位TOP
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PCR)。本专利技术的数位TOP
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PCR的特征在于使用与样本中所有核酸片段的末端连接的均质衔接子(homogeneous adapter，HA)以及识别HA中互补序列的单一型引子(T/U寡核苷酸)，并作为正向及反向引子以进行扩增。本专利技术的数位TOP
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PCR可以扩增样本中的所有核酸片段，进而可藉由增加的灵敏度，特别是降低伪阴性率，以实现目标核酸的后续检测。
[0011]具体而言，本专利技术提供一种用于分析样本中的核酸的方法，该样本包含一或多个线性、双链核酸片段(NA片段)，该方法包括以下步骤：
[0012](a)使该样本进行3'
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A尾加工反应，允许在该NA片段的3'
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尾添加腺嘌呤核苷酸(A)以产生3'
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腺嘌呤核苷酸(3'
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A)突出端核酸片段(3'
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A突出的NA片段)；
[0013](b)提供3'
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胸腺嘧啶(T)或3'
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尿嘧啶(U)核苷酸突出的双链均质衔接子，其包含携带5'
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磷酸的P寡核苷酸链以连接至该3'
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A突出的NA片段以及带有3'
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T或3'
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U而不带有5'
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磷酸的一T/U寡核苷酸链，其中该T/U寡核苷酸链与该P寡核苷酸链互补，除了在该T/U寡核苷酸链的3'
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T或3'
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U之外；
[0014](c)使(a)的样本进行连接反应，以使该均质衔接子在两端与该3'
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A突出的NA片段连接，以产生衔接子连接的核酸片段(衔接子连接的NA片段)；
[0015](d)将(c)的样本与聚合酶连锁反应(PCR)试剂及检测试剂结合以提供准备好扩增/检测的样本，其中该PCR试剂包括用于扩增的单一型引子，其具有该T/U寡核苷酸链的核酸序列，且该检测试剂包括一或多种用于检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分析样本中核酸的方法，该样本包含一或多个线性、双链核酸片段(NA片段)，该方法包括以下步骤：(a)使该样本进行3'
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A尾加工反应，允许在该NA片段的3'
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尾添加腺嘌呤核苷酸(A)以产生3'
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腺嘌呤核苷酸(3'
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A)突出端核酸片段(3'
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A突出的NA片段)；(b)提供3'
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胸腺嘧啶(T)或3'
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尿嘧啶(U)核苷酸突出的双链均质衔接子，其包含带有5'
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磷酸的P寡核苷酸链以连接至该3'
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A突出的NA片段以及带有3'
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T或3'
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U而不带有5'
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磷酸的T/U寡核苷酸链，其中该T/U寡核苷酸链与该P寡核苷酸链互补，除了在该T/U寡核苷酸链的3'
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T或3'
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U之外；(c)使(a)的样本进行连接反应，以使该均质衔接子在两端与该3'
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A突出的NA片段连接，以产生衔接子连接的核酸片段(衔接子连接的NA片段)；(d)将(c)的样本与聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂以及检测试剂组合以提供准备好扩增/检测的样本，其中该PCR试剂包括用于扩增的具有该T/U寡核苷酸链的核酸序列的单一型引子，且该检测试剂包括产生荧光信号并与该NA片段特异性杂交的一或多种荧光探针；(e)将(d)的该准备好扩增/检测的样本分成复数个分区，每个分区包含该衔接子连接的NA片段的有限个复制；(f)以该衔接子连接的NA片段为模板，以该单一型引子作为正向及反向引子在每个分区中进行PCR，以扩增该衔接子连接的NA片段；以及(g)评估每个部分的荧光信号。2.如权利要求1的方法，其中步骤(g)包括检测包含扩增的衔接子连接的NA片段的所有分区的荧光颜色(信号)，并计数具有预期荧光颜色的分区的数量，进而确定该样本中的NA片段的预估量。3.如权利要求1的方法，其中在步骤(e)中，超过50％的分区含有不超过一个复制的衔接子连接的NA片段。4.如权利要求1的方法，其中在步骤(e)中，每个分区包含至少一个复制的该衔接子连接的NA片段。5.如权利要求1的方法，其中该NA片段包含可表示该个体的健康/疾病状态的核酸序列。6.如权利要求1的方法，其中步骤(b)的该均质衔接子不自体连接。7.如权利要求1的方法，其中步骤(b)的该均质衔接子在该T/U寡核苷酸链中具有3'
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T或3'
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U突出端，且在该P寡核苷酸链中具有3'
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非
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A突出端。8.如权利要求1的方法，其中步骤(b)的该均质衔接子的一端为3'
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T突出端，另一端为钝端。9.如权利要求1的方法，其中该样本是由体液样本所获得。10.如权利要求1的方法，其中该样本中的该NA片段为无细胞DNAs。11.如权利要求1的方法，其中在步骤(a)之前，进一步包括对该NA片段进行末端修复反应。12.如权利要求1的方法，其中步骤(f)的该PCR通过油乳剂或液滴PCR，或基于孔的PCR进行。
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【专利技术属性】
技术研发人员：邱国平，
申请(专利权)人：台湾地区中央研究院地址，
类型：发明
国别省市：