检测同一样品中DNA和RNA的方法技术

本公开提供了用于对核酸靶标(例如，样品混合物中共同扩增的DNA和RNA，例如通过使用RNA的替代物)进行测序的方法。此类方法可用于确定样品中是否存在一种或更多种核酸靶标。确定样品中是否存在一种或更多种核酸靶标。确定样品中是否存在一种或更多种核酸靶标。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测同一样品中DNA和RNA的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2018年12月31日提交的美国临时申请号62/787,114的优先权，其通过引用以其全文并入本文。


[0003]本公开提供了定量核酸酶保护测序(qNPS)方法，其允许对核酸靶标进行测序(例如通过共同扩增同一样品中的DNA和RNA替代物)。此类方法可用于确定样品中是否存在一种或更多种核酸靶标，并且在一些实例中是定量的。

技术介绍

[0004]尽管核酸分子测序的方法是已知的，但仍需要允许对样品混合物中共同扩增的RNA和DNA进行测序的方法。利用在样品混合物中共同扩增的DNA和RNA的多重核酸分子测序反应方法尚未以最理想的性能或简易的水平实现。

技术实现思路

[0005]提供了改进先前的定量核酸酶保护测序(qNPS)方法(诸如美国公开号US 2011
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0104693和美国专利号8,741,564中公开的那些方法)并且代表对当前核酸测序方法的改进的方法。在一些实例中，所公开的方法通过共同扩增来自同一样品的两种分子，通过使用RNA替代物分子，对同一样品(诸如同一活检样品或同一组织样品)中的至少一种靶DNA和至少一种靶RNA进行测序或检测。在一些实例中，同时分析多个不同的(例如，唯一的)样品。在一些实例中，靶RNA和DNA分子具有点突变、缺失、插入或其组合。在一些实例中，该方法确定一种或更多种靶RNA的丰度(例如，定量或定性)并确定一种或更多种靶DNA序列中是否存在基因组突变。
>[0006]所公开的确定样品(例如，经固定的样品，诸如经福尔马林固定的样品)中靶DNA分子(例如，靶基因组分子)和靶RNA分子(例如，靶mRNA或靶miRNA分子)的序列的方法可以包括用裂解缓冲液(例如，包括去污剂和/或离液剂的裂解缓冲液)裂解样品，从而产生包含靶DNA分子和靶RNA分子的裂解物。该裂解物被分成至少两个不同的部分，例如具有等体积或等核酸含量。
[0007]使用至少一种引物(例如，靶DNA引物，诸如第一正向引物和第一反向引物)从裂解物的第一部分扩增靶DNA，从而产生带侧翼的扩增子区(FAR)。在一些实例中，从细胞裂解物的第一部分扩增靶DNA使用至少两种引物(例如，至少两种靶DNA引物)，每种DNA引物在其5'端具有侧翼序列。例如，第一靶DNA引物(诸如正向引物)可以在其5'端具有侧翼序列，该侧翼序列是包含侧翼序列的核酸酶保护探针(NPPF
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见下文)的3'
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侧翼序列的反向互补序列，而第二靶DNA引物(诸如反向引物)可以在其5'端具有与NPPF的5'
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侧翼序列相同的侧翼序列。DNA引物上的这些侧翼序列允许将侧翼序列添加至DNA扩增子中，从而产生带侧翼的扩增子区(FAR)。在一些实例中，添加的侧翼序列各自为约10至50个核苷酸(nt)，诸如各自
25nt。在一些实例中，从靶标扩增的DNA的长度为约40至150nt，诸如40至125nt或40至100nt。在一些实例中，生成的FAR的长度为约100至200nt，诸如160至200nt。
[0008]在足以使NPPF与存在于裂解物的第二部分中的靶RNA分子特异性结合的条件下，将裂解物的第二(即不同的)部分与至少一种包含侧翼序列的核酸酶保护探针(NPPF)孵育。在一些实例中，NPPF是长度为约50至200nt，诸如60至200nt、75至150、或65至100nt的DNA分子。NPPF包括(1)5'端，(2)3'端，(3)与靶RNA分子的全部或一部分互补的序列(例如，长度为约10
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60nt，诸如16至50nt)，从而允许靶RNA分子和NPPF之间的特异性结合或杂交，和(4)侧翼序列。例如，与靶RNA分子的区域互补的NPPF的区域以高特异性与靶RNA分子的该区域结合或杂交。在一些实例中，侧翼序列位于与靶RNA分子互补的序列的5'、3'或两者，诸如处于与靶RNA分子互补的序列的5'的5'
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侧翼序列和处于与靶RNA分子互补的序列的3'的3'
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侧翼序列。在一些实例中，侧翼序列包括在样品中存在的核酸分子中未发现的至少12个连续核苷酸。
[0009]在一些实例中，NPPF包括5'
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侧翼序列，并且该方法进一步包括在足以使5'
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侧翼序列与与5'
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侧翼序列互补的序列(5CFS)特异性杂交的条件下，使裂解物的第二部分与包括5CFS的核酸分子(例如，DNA或RNA)接触。在一些实例中，NPPF包括3'
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侧翼序列，并且该方法进一步包括在足以使3'
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侧翼序列与与3'
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侧翼序列互补的序列(3CFS)特异性杂交的条件下，使裂解物的第二部分与包括3CFS的核酸分子(例如，DNA或RNA)接触。在一些实例中，NPPF包括3'
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和5'
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侧翼序列，并且该方法进一步包括在足以使3'
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侧翼序列与3CFS特异性杂交并且5'
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侧翼序列与5CFS特异性杂交的条件下，使裂解物的第二部分与3CFS和5CFS接触。杂交导致产生双链(ds)核酸分子，即与(1)靶RNA分子和(2)5CFS和/或3CFS杂交的NPPF。在一些实例中，NPPF中的至少一个核苷酸与靶RNA分子中的相应核苷酸不具有互补性或者与5CFS或3CFS中的相应核苷酸不具有互补性。
[0010]在足以降解(水解)或去除裂解物的第二部分中未结合的单链(ss)核酸分子的条件下，使存在于裂解物的第二部分中的所得双链(ds)核酸分子，即与(1)靶RNA分子，和(2)5CFS和/或3CFS杂交的NPPF与对ss核酸分子具有特异性的核酸酶(例如，核酸外切酶、核酸内切酶或其组合，诸如S1核酸酶)接触。因此，例如，未结合靶RNA或CFS的NPPF、未结合的RNA分子、靶RNA分子的未结合部分、未结合的CFS、和裂解物第二部分中的其他ss核酸分子被降解。这导致裂解物的第二部分含有经消化的样品，该经消化的样品包括与其靶RNA分子杂交、与其相应的3CFS杂交、与其相应的5CFS杂交、或与其相应的3CFS及其相应的5CFS杂交的NPPF。
[0011]裂解物的第二部分中的这种ds核酸分子(NPPF：靶RNA分子：CFS)可以分离成其相应的ss核酸分子(例如通过加热，例如加热至95℃至100℃)，从而产生ssNPPF、ssCFS和ss靶RNA分子的混合物。在一些实例中，这种分离作为如下描述的第二扩增(FAR和ssNPPF的扩增)的第一步发生。在一个实例中，NPPF：RNA靶标的RNA链可以通过用RNase H处理复合体以选择性去除，该RNase H选择性去除DNA：RNA复合体的RNA部分(例如，如果靶分子是RNA，NPPF是DNA，3CFS和5CFS是DNA)。可以使用其他核酸酶任选地从DNA单独降解RNA。
[0012]该方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种确定样品中靶DNA分子和靶RNA分子的序列的方法，包括：用裂解缓冲液裂解所述样品，从而产生包含所述靶DNA分子和所述靶RNA分子的裂解物；使用至少一种靶DNA引物从所述裂解物的第一部分扩增所述靶DNA，从而产生带侧翼的扩增子区(FAR)；在足以使包含侧翼序列的核酸酶保护探针(NPPF)与所述靶RNA分子特异性结合的条件下，将所述裂解物的第二部分与至少一种NPPF孵育，其中所述NPPF包含：5'端和3'端，与所述靶RNA分子的区域互补的序列，允许所述NPPF和所述靶RNA分子之间的特异性结合，其中所述侧翼序列位于与所述靶RNA分子互补的序列的5'、3'或两者，其中5'
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侧翼序列处于与所述靶RNA分子互补的序列的5'，并且3'
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侧翼序列处于与所述靶RNA分子互补的序列的3'，其中所述侧翼序列包含在所述样品中存在的核酸分子中未发现的至少12个连续核苷酸，如果所述NPPF包含5'
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侧翼序列，则在足以使所述5'
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侧翼序列与与所述5'
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侧翼序列互补的序列(5CFS)特异性杂交的条件下，使所述裂解物的所述第二部分与包含所述5CFS的核酸分子接触；如果所述NPPF包含3'
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侧翼序列，则在足以使所述3'
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侧翼序列与与所述3'
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侧翼序列互补的序列(3CFS)特异性杂交的条件下，使所述裂解物的所述第二部分与包含所述3CFS的核酸分子接触；产生与所述靶RNA分子杂交、与所述3CFS杂交、与所述5CFS杂交、或与所述3CFS和所述5CFS两者杂交的NPPF；在足以去除未结合的核酸分子的条件下，使所述裂解物的所述第二部分与对单链核酸分子具有特异性的核酸酶接触，从而产生所述裂解物的经消化的第二部分，其包含与所述靶RNA分子杂交、与所述3CFS杂交、与所述5CFS杂交、或与所述3CFS和所述5CFS两者杂交的NPPF；任选地将所述NPPF与所述靶RNA分子以及与所述3CFS、5CFS、或所述3CFS和所述5CFS两者分离，从而产生单链NPPF；将所述FAR和(i)单链NPPF或(ii)与所述靶RNA分子杂交、与所述3CFS杂交、与所述5CFS杂交、或与所述3CFS和所述5CFS杂交的NPPF合并，从而产生FAR：单链NPPF混合物；扩增所述FAR：单链NPPF混合物中的所述FAR和所述单链NPPF，从而产生FAR扩增子和NPPF扩增子；并且对至少一部分所述FAR扩增子和至少一部分所述NPPF扩增子进行测序，从而确定所述样品中所述靶DNA分子和所述靶RNA分子的序列。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述NPPF包含5'
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侧翼序列和3'
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侧翼序列，并且扩增所述FAR和所述单链NPPF包括使所述FAR和所述单链NPPF与包含与所述5'
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侧翼序列相同的区域的第一扩增引物和包含与所述3'
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侧翼序列互补的区域的第二扩增引物接触。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一扩增引物和/或所述第二扩增引物进一步包含在所述FAR和所述单链NPPF的扩增过程中允许将实验标签、测序接头或两者附着至所述FAR扩增子或NPPF扩增子的一个或更多个序列。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述实验标签或测序接头的长度为12至50个核苷酸。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述至少一种靶DNA引物包含至少两种靶DNA引物，每种在其5'端包含侧翼序列，其中第一靶DNA引物包括包含所述3'
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侧翼序列的反向互补序列的侧翼序列，并且其中第二靶DNA引物包括包含所述5'
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侧翼序列的序列的侧翼序列。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中从所述裂解物的第一部分扩增所述靶DNA包括8至12个扩增循环。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中扩增所述FAR和所述单链NPPF的扩增包括8至25个扩增循环。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述靶DNA分子是靶基因组DNA分子。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述裂解缓冲液包含去污剂和离液剂。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述5CFS和3CFS是DNA。11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中确定所述样品中所述靶RNA分子的序列包括确定所述样品中所述靶RNA的绝对或相对丰度。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述NPPF包含DNA分子。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述NPPF的长度为35至200个核苷酸。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中与所述靶核酸分子的...

【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：HTG分子诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：