弥漫性B细胞淋巴瘤(DLBCL)亚型分型的方法技术

本文描述了用于分类DLBCL亚型的创新，以及将该分类结果用于诊断、预后以及治疗选择的创新。以此方式，该分类器可有效地分类DLBCL亚型并提供有意义的输出，有利于医疗实践和DLBCL患者。还描述了可用于测量DLBCL标签基因的表达的阵列和试剂盒。

Classification of diffuse B cell lymphoma (DLBCL) subtypes

This article describes the innovations used to classify DLBCL subtypes and the innovations used to classify the results for diagnosis, prognosis, and treatment options. In this way, the classifier can effectively classify DLBCL subtypes and provide meaningful outputs for medical practice and DLBCL patients. Arrays and kits that can be used to measure the expression of DLBCL tag genes are also described.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】弥漫性B细胞淋巴瘤(DLBCL)亚型分型的方法相关申请的交叉引用本申请要求2015年9月29日提交的美国临时申请No.62/234,491的优先权，通过引用将其并入本文。
本公开涉及用于区分弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)亚型的分类器(classifier)、阵列和试剂盒，以及将该分类结果用于诊断、预后和/或治疗选择。
技术介绍
淋巴瘤是最常见的血癌。两种主要形式的淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma)和非霍奇金淋巴瘤。弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuselargeB-celllymphoma，DLBCL)是最常见形式的非霍奇金淋巴瘤，在新诊断病例占多至30％。DLBCL可以基于基因表达标志物进一步表征为生发中心B细胞样(GCB)亚型或非GCB样(包括活化B细胞样(ABC))亚型。GCB和非GCB(例如ABC)亚型分型可以用于(i)预测淋巴瘤患者的预后，GCB样淋巴瘤比非GCB(或ABC)亚型有更佳预后；和/或(ii)确定对淋巴瘤患者的治疗，例如采用GBC或ABC靶向疗法，或者基于疾病侵袭性来确定(ABC通常比GBC病更有侵袭性)。对于区分GCB和非GCB(例如，ABC)DLBCL亚型和/或对于确定DLBCL患者的预后或对DLBCL患者的处理，没有单一的、可接受的诊断试验。在临床实践中，存在数种基于免疫组化(IHC)的测试，包括Colomo等，(Blood101(1):78-84,2003)，Hans等，(Blood103:275-282,2004)，Muris等(J.Pathol.208(5):714-23,2006)，Choi等(Mod.Pathol.21:250A,2008)，以及Tally(Meyer等，J.Clin.Oncol.29(2):200,2011)测试。由于DLBCL具有各种各样的临床结果，因此认为该疾病的分子基础同样复杂，对临床上有用的生物标志物的发现正在进行中。此类工作的一个目标是“将临床异质性诊断类别细分为具有更佳均匀性临床行为的分子上独特的疾病”(Alizadeh等，Nature403:503,2000)。在这方面，至少由于仅可同时检测到(co-detected)有限数量的蛋白标志物的原因，IHC是具有固有局限性的技术。类似地，基因组分析(例如，DNA)受限至少是因为不清楚基因组事件是否表达为对该生物学系统有功能性影响。mRNA转录组(mRNAtranscriptome)相对于蛋白和DNA分析具有优势，因为mRNA表达提供了对基因组活性的快照，并且适合于相同样品中很多生物标志物的多重检测。已有报道，数种mRNA在DLBCL样品中差异表达(例如，Alizadeh等，Nature,403:503,2000；Rosenwald等，NEJM346(25):1937,2002；Wright等，Proc.Natl.Acad.Sci.100:9991,2003；以及Roberts等，Lab.Invest.78:979,2007)。但是，该领域中仍有重大差距仍有待解决。专利技术概要对跨各种检测技术的生物标志物(其表达为DLBCL特征性的)的鉴定为重要的第一步(例如，Roberts等，Lab.Invest.78:979,2007)。然而，从实践和临床视角来看，仍然存在的关键性挑战为将大量的神秘表达数据(arcaneexpressiondata)合成有意义的输出，以有利于医疗实践和DLBCL患者。本公开描述了用于分类DLBCL亚型的创新，以及将该分类结果用于诊断、预后以及治疗选择的创新。例如，分类器(其可为计算机可实现的)基于基因表达，例如来自DLBCL受试者的样品中两个或更多个标签基因的表达水平，来确定DLBCL的亚型。在一些实例中，表达通过给定基因的测序读取数(read)占读取数总数的比例数来测量(其中读取数为可通过测序仪读取的(例如来自探针的)特定序列的互补性拷贝的数量)。该分类器可有效地分类DLBCL亚型并提供有意义的输出，有利于医疗实践和DLBCL患者。根据本创新的一个方面，该方法测量样品中多个DLBCL标签基因表达水平(例如，核酸或蛋白)。例如，该方法可测量CD47、CD86、IL16、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8和TYMS中至少两个，或者CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8和TYMS中至少两个的表达(例如测量这些基因全部16个的表达)。可对每个基因获得的表达值加权，并对加权的表达值求和。可确定采用该经加权的表达值总和的概率评分。该方法或分类器相对于用于该DLBCL分类器的相应阈值来评估或比较该概率评分。然后，至少部分地基于该评分结果，该方法将该DLBCL样品分类为活化B细胞样(ABC)、生发中心B细胞样(GCB)或未分类。对DLBCL亚型的分类可作为方法的一部分、作为适于执行该方法的计算系统的一部分或作为有形的计算机可读介质(存储使计算系统执行该方法的计算机可执行指令)的一部分来实现。本文描述的创新还包括将该分类结果用于DLBCL患者的诊断、预后和/或治疗选择。本文还描述了可用于确定DLBCL标签基因的表达的阵列和试剂盒。根据以下参照附图进行的详细描述，本公开的前述和其它特征将变得更加明显。附图简要说明图1为阐述用于分类DLBCL亚型的总体技术的流程图。图2为显示用于DLBCL分类器模型训练和验证的病例的流程图。图3为显示包括在DLBCL测定中用于训练和验证分类器实施方案的96个基因跨样品表达分布的图。图4为显示为未分类样品确定下限的手段的图。图5为显示DLBCL样品的验证集合的分类(即，ABC、GBC或未分类)的图，这些DLBCL样品事先已通过临床上接受的方法表征为ABC(黑点)或GBC(红点)。样品沿x轴标识。y轴显示基于基因表达谱的针对每个病例的预测概率。在本实施方案中，用于针对GCB样品的估计概率的截止值为0.57(预测概率>0.57为GCB)，用于针对ABC分类的截止值为低于0.43(预测概率<0.43)，以及未分类样品落入中间并包括该ABC和GCB截止值(0.43≤预测概率≥0.57)。图6为显示从GCBFFPE样品制备的裂解物中用于CD274(PDL-1)和PDCD1(PD1)的Log2CPM的图。图7为显示从ABCFFPE样品制备的裂解物中用于CD274(PDL-1)和PDCD1(PD1)的Log2CPM的图。图8为显示针对每个重复和条件的分类图的图。序列表本文列出的核酸序列采用用于核苷酸碱基的标准字母缩写来显示，如37C.F.R.1.822中所定义的。仅显示了每条核酸序列的一条链，但理解为互补链被包含在对所显示链的任何引用中。随本文提交的序列表通过引用并入(2016年9月1日生成，3.62KB)。在提供的序列中：SEQIDNO:1-16为示例性探针核酸序列。专利技术详细描述除非另有说明，否则技术术语按常规用法使用。对分子生物学中常见术语的定义可以在牛津大学出版社出版的BenjaminLewin,GenesV,1994(ISBN0-19-854287-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分类弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的方法，包括：在从受试者获得的样品中测量CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8和TYMS的表达，由此获得CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8和TYMS的表达值；为每个表达值加权，由此产生经加权的表达值；对所述经加权的表达值求和，由此产生经加权的表达值总和；使用所述经加权的表达值总和计算概率评分；将所述概率评分与阈值比较；以及当所述概率评分为用于针对ABC的范围内的值时将所述DLBCL分类为活化B细胞样(ABC)；当所述概率评分为用于针对GCB的范围内的值时将所述DLBCL分类为生发中心B细胞样(GCB)；或当所述概率评分为用于针对未分类的范围内的值时将所述DLBCL分类为未分类。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.09.29 US 62/234,4911.分类弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的方法，包括：在从受试者获得的样品中测量CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8和TYMS的表达，由此获得CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8和TYMS的表达值；为每个表达值加权，由此产生经加权的表达值；对所述经加权的表达值求和，由此产生经加权的表达值总和；使用所述经加权的表达值总和计算概率评分；将所述概率评分与阈值比较；以及当所述概率评分为用于针对ABC的范围内的值时将所述DLBCL分类为活化B细胞样(ABC)；当所述概率评分为用于针对GCB的范围内的值时将所述DLBCL分类为生发中心B细胞样(GCB)；或当所述概率评分为用于针对未分类的范围内的值时将所述DLBCL分类为未分类。2.权利要求1的方法，其中测量核酸表达。3.权利要求2的方法，其中所述核酸为mRNA和/或miRNA。4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述样品为经固定的样品。5.权利要求1至4中任一项的方法，其中测量表达包括使用基于核酸酶的测定来分析所述样品。6.权利要求1至5中任一项的方法，其中测量表达包括测序，并且其中所述表达值为代表存在于所述样品中的分子数量的计数。7.权利要求1至6中任一项的方法，其中测量表达包括对表达的定量。8.权利要求1至7中任一项的方法，其中对每个表达值加权包括以显示在表5中的系数乘以所述表达值。9.权利要求1至8中任一项的方法，其中采用下式计算概率评分：其中β0为常数，β为用于分类器基因的权重向量，以及xT为针对给定样品的所述分类器基因的测量值向量。10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述阈值为概率评分t截止值。11.权利要求10的方法，其中所述概率评分t截止值为，<0.43用于针对ABC，>0.57用于针对GCB，以及0.43-0.57用于针对未分类。12.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述受试者为已知患有DLBCL或怀疑患有DLBCL。13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述方法将少于6％的样品分类为未分类。14.权利要求1至13中任一项的方法，其中所述表达值如下获得：将所述样品与包括侧翼序列的核酸酶保护探针(NPPF)在足以让每个NPPF特异结合其靶核酸分子的条件下接触；将所述样品与包括与所述侧翼序列互补的序列的核酸分子(CFS)在足以让所述侧翼序列特异结合所述CFS的条件下接触；将所述样品与特异于单链核酸分子的核酸酶在足以除去未结合核酸分子的条件下接触，由此产生经消化的样品，所述经消化的样品包括杂交至所述靶核酸分子的NPPF和杂交至所述CFS的NPPF；用扩增引物扩增所述经消化的样品中的NPPF，由此产生NPPF扩增子；对所述NPPF扩增子的至少一部分测序；以及对NPPF扩增子的数量计数；由此确定所述样品中CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8和TYMS的表达值。15.权利要求1至13中任一项的方法，其中所述表达值如下获得：将所述样品与特异于CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8和TYMS靶核酸分子的NPPF接触，其中每个NPPF包括：5′-末端和3′-末端，与CD47、CD86、ENTPD1、FOXP1、FUT8、IL16、ITPKB、LRMP、MME、NF2、PIM1、PTPRC、REL、STAT3、TNFRSF8和TYMS靶核酸分子的区域互补的序列，其允许所述NPPF和所述靶核酸分子之间特异结合，其中所述侧翼序列位于所述与靶核酸分子互补的序列的5'、3'或两端，其中5′-侧翼序列为所述与靶核酸分子互补的序列的5'，3′-侧翼序列为所述与靶核酸分子互补的序列的3'，其中所述侧翼序列包括未在存在于所述样品内的核酸分子中发现的至少12个连续核苷酸，如果所述NPPF包括5′-侧翼序列，则将所述样品与包括与所述5′-侧翼序列互补的序列的核酸分子(5CFS)、5′-末端磷酸酯...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·拉弗勒，Q·刘，J·W·吕克，P·C·罗氏，
申请(专利权)人：HTG分子诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US