【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测核苷酸变异的核酸酶保护方法相关申请的交叉引用本申请要求于2012年6月29日提交的美国临时申请61/666,456和于2013年5月30日提交的美国临时申请61/829,102的优先权,所述临时申请的全文以引用的方式纳入本说明书。
本公开内容涉及检测靶核酸分子中的一种或多种核苷酸变异的方法,特别是利用核酸酶保护方法。
技术介绍
许多疾病或紊乱的特征在于破坏蛋白质表达或活性、或破坏细胞信号通路而导致对细胞过程的异常控制或导致细胞的不受控生长和增殖。这些破坏通常是由遗传改变(也称为突变)或影响特定蛋白活性或表达的其他改变引起。许多疾病的诊断和/或治疗方法的选择包括鉴别来自已知或疑似患特定疾病的受试者的样本中特定的遗传改变。需要持续开发诊断测试和方法,用于检测人类疾病的发生和发展中涉及的突变和分子特征。此类方法和诊断测试尤其将有助筛选于新药物,以及开发选择用于治疗的患者并监测患者对靶向治疗的反应的方法。
技术实现思路
本说明书公开的是利用核酸酶保护测定来检测靶核酸中核苷酸变异的存在的方法。在一个实施例中,所述方法包括使样品与至少两种探针接触,其中所述第一探针包括与靶核酸中的核苷酸变异位置处的野生型(非变异)核苷酸互补的核苷酸,所述第二探针包括与靶核酸中的核苷酸变异位置处的变异核苷酸互补的核苷酸。使所述样品与所述至少两种探针在足以使所述探针与所述靶核酸杂交的条件下接触,产生杂交的和未杂交的核酸分子的混合物。使所述混合物与特异性针对单链核酸分子的核酸酶接触,接触条件为足以移除未杂交核酸分子(或核酸分子的未杂交部分)的条件。然后检测核酸酶处理后剩余的至少两个探针的 ...
【技术保护点】
一种检测样品中靶核酸中的核苷酸变异的存在的方法,包括:使所述样品与至少两种与包含核苷酸变异的靶核酸分子互补的探针在足以使第一探针和第二探针与所述靶核酸杂交的条件下接触,产生杂交的核酸分子和未杂交的核酸分子的混合物,其中所述第一探针在所述靶核酸分子核苷酸变异处与野生型互补,其中所述靶核酸分子核苷酸变异位置距所述第一探针末端至少两个碱基,其中所述第二探针在所述靶核酸分子核苷酸变异处与第一变异互补,其中所述靶核酸核苷酸变异位置距所述第二探针末端至少两个碱基;在足以移除未杂交的核酸分子的条件下,使杂交的核酸分子和未杂交的核酸分子的混合物与特异性针对单链核酸分子的核酸酶接触;并且检测所述混合物中一种或多种探针的存在,从而检测所述样品中核苷酸变异的存在。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.06.29 US 61/666,456;2013.05.30 US 61/829,1021.一种检测样品中靶核酸分子中的核苷酸变异的存在的非诊断方法,包括:使所述样品与至少两种与包含核苷酸变异的靶核酸分子的相同链互补的探针在足以使第一探针和第二探针与所述靶核酸分子杂交的条件下接触,产生杂交的核酸分子和未杂交的核酸分子的混合物,其中所述第一探针在所述靶核酸分子核苷酸变异处与野生型互补,其中所述靶核酸分子核苷酸变异位置距所述第一探针的3’末端两个至六个碱基,其中所述第二探针在所述靶核酸分子核苷酸变异处与第一变异互补,其中所述靶核酸核苷酸变异位置距所述第二探针的5’末端两个至六个碱基,并且其中所述第一和第二探针仅在所述第一探针的3’末端和所述第二探针的5’末端所述变异位置的区域处重叠;或者其中所述第一探针在所述靶核酸分子核苷酸变异处与野生型互补,其中所述靶核酸分子核苷酸变异位置距所述第一探针的5’末端两个至六个碱基,其中所述第二探针在所述靶核酸分子核苷酸变异处与第一变异互补,其中所述靶核酸核苷酸变异位置距所述第二探针的3’末端两个至六个碱基,并且其中所述第一和第二探针仅在所述第一探针的5’末端和所述第二探针的3’末端所述变异位置的区域处重叠;在足以移除未杂交的核酸分子的条件下,使杂交的核酸分子和未杂交的核酸分子的混合物与特异性针对单链核酸分子的核酸酶接触;并且检测所述混合物中至少两种探针中的一种或多种探针的存在,从而检测所述样品中核苷酸变异的存在。2.权利要求1的方法,其中所述核苷酸变异位置距离所述第一探针的5’末端和所述第二探针的3’末端3个碱基;或者所述核苷酸变异位置距离所述第一探针的3’末端和所述第二探针的5’末端3个碱基。3.权利要求1或2的方法,其中所述第一探针和所述第二探针各包含一个可检测标记。4.权利要求3的方法,其中所述第一探针和所述第二探针是末端标记的。5.权利要求4的方法,其中:所述靶核酸分子核苷酸变异位置距离所述第一探针的5’末端2-6个碱基,并且所述可检测标记位于所述第一探针的5’末端,以及所述靶核酸分子核苷酸变异位置距离所述第二探针的3’末端2-6个碱基,并且所述可检测标记位于所述第二探针的3’末端。6.权利要求4的方法,其中:所述靶核酸分子核苷酸变异位置距离所述第一探针的3’末端2-6个碱基,并且所述可检测标记位于所述第一探针的3’末端,以及所述靶核酸分子核苷酸变异位置距离所述第二探针的5’末端2-6个碱基,并且所述可检测标记位于所述第二探针的5’末端。7.权利要求3的方法,其中所述可检测标记包括半抗原、荧光分子、酶或放射性同位素。8.权利要求7的方法,其中所述可检测标记包括生物素。9.权利要求8的方法,其中检测混合物中一种或多种所述探针的存在包括使所述探针与亲和素或链霉亲和素接触,所述亲和素或链霉亲和素缀合到辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。10.权利要求3的方法,其中所述第一探针和所述第二探针包含不同的可检测标记。11.权利要求3的方法,其中所述第一探针和所述第二探针包含相同的可检测标记。12.权利要求3的方法,还包括使所述样品与第三探针在足以使所述第三探针与所述靶核酸杂交的条件下接触,所述第三探针与靶核酸分子核苷酸变异处的第二变异互补且所述第三探针的5’末端包含可检测标记,其中所述靶核酸核苷酸变异位置距离所述第三探针的经标记5’末端2-6个碱基并且其中所述第一和第三探针仅在所述第一探针的3’末端和所述第三探针的5’末端重叠;或者所述第三探针与靶核酸分子核苷酸变异处的第二变异互补且所述第三探针的3’末端包含可检测标记,其中所述靶核酸核苷酸变异位置距离所述第三探针的经标记3’末端2-6个碱基并且其中所述第一和第三探针仅在所述第一探针的5’末端和所述第三探针的3’末端重叠。13.权利要求12的方法,还包括使所述样品与第四探针在足以使所述第四探针与所述靶核酸杂交的条件下接触,所述第四探针与靶核酸分子核苷酸变异处的第三变异互补且所述第四探针的5’末端包含可检测标记,其中所述靶核酸核苷酸变异位置距离所述第四探针的经标记5’末端2-6个碱基并且其中所述第一和第四探针仅在所述第一探针的3’末端和所述第四探针的5’末端重叠;或者还包括使所述样品与第四探针在足以使所述第四探针与所述靶核酸杂交的条件下接触,所述第四探针与靶核酸分子核苷酸变异处的第三变异互补且所述第四探针的3’末端包含可检测标记,其中所述靶核酸核苷酸变异位置距离所述第四探针的经标记3’末端2-6个碱基并且其中所述第一和第四探针仅在所述第一探针的5’末端和所述第四探针的3’末端重叠。14.权利要求1或2的方法,其中所述足以使至少两种探针与靶核酸分子杂交的条件包括将所述至少两种探针与所述样品在50℃下孵育16小时。15.权利要求1或2的方法,其中所述至少两种探针均包含18-75个核苷酸。16.权利要求15的方法,其中所述至少两种探针均具有50℃-70℃的解链温度(Tm)。17.权利要求16的方法,其中所述至少两种探针均具有60℃的解链温度(Tm)。18.权利要求15的方法,其中所述至少两种探针均包含20-41个核苷酸。19.权利要求1或2的方法,其中所述探针中的至少一种包含一个或多个经修饰的核苷酸。20.权利要求19的方法,其中所述一种或多种经修饰的核苷酸包括锁核酸、肽核酸,或其中两种或...
【专利技术属性】
技术研发人员:M·朗塞维尔,B·塞利格曼,
申请(专利权)人:HTG分子诊断有限公司,
类型:发明
国别省市:美国;US
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