溶菌酶的变体及编码该变体的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及变体溶菌酶。本发明专利技术还涉及编码该变体溶菌酶的多核苷酸，并且涉及包含该多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及溶菌酶的变体、编码该变体的多核苷酸和产生该变体的方法。
技术介绍
溶菌酶(EC 3. 2. I. 17)，也称为胞壁酸酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanhydrolase),催化在肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰_D_葡糖胺残基之间的和在壳糊精中的N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1，4-β -键的水解。 溶菌酶一般由许多生物体如病毒、植物、昆虫、鸟类、爬行动物和哺乳动物产生作为针对细菌的防御机制。该酶通过切割肽聚糖的糖苷键引起细菌细胞壁的水解；所述肽聚糖是细菌中的重要结构分子。在其细胞壁已由溶菌酶作用削弱后，细菌细胞因渗透压引起裂解。在溶菌酶作为抗菌剂的潜力中存在越来越多的兴趣。例如，溶菌酶活性已显示针对病原体，例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophilus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、生抱梭菌(Clostridium sporogenes)、酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)、和单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)。溶菌酶已分类成五个不同糖苷水解酶(GH)家族(CAZy, www.cazy.org):鸡蛋清溶菌酶(GH22)、鹅蛋清溶菌酶(GH23)、细菌噬菌体T4溶菌酶(GH24)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)鞭毛蛋白质(GH73)和拟鞘孢属(Chalaropsis)溶菌酶(GH25)。已发现溶菌酶家族GH25与其他溶菌酶家族在结构上无关。溶菌酶的用途已在动物饲料(参见例如WO 00/21381和WO 04/026334)、干酪生产(参见例如 WO 05/080559)、食品保存(Hughey 和 Johnson (1987) Appl Environ Microbiol53:2165)、去污剂(参见例如US 5，041，236和EP 0425016)、口腔护理(参见例如US4，355，022、WO 04/017988和WO 08/124764)、美容学和皮肤病学、避孕、泌尿学和妇科学(参见例如WO 08/124764)中提出。鸡蛋清溶菌酶是商购可得的溶菌酶产品。从微生物来源中分离的溶菌酶也是已知的。专利技术概述 本专利技术涉及溶菌酶变体及编码它的核苷酸序列。在一个方面，本专利技术涉及属于糖基水解酶家族25 (GH25)的溶菌酶变体，其包含在选自下组的位置编号的一个或多个位置上的氨基酸序列的改变47、111、108、45、22、110、120、147、196、49、55、193、161、128、131、203、98、112、55、32、89、206 121、120、185、113、I19、35、153、158、171、195、76、164、30、85、178、183、186、112、174、187、197、102、134、108、196、197、198、56、19、120、20、135 和 203，所述位置对应于氨基酸序列SEQ ID NO:3中的位置，并且其中所述溶菌酶变体具有抗微生物和/或溶菌酶活性。在一个实施方案中，溶菌酶变体是真菌溶菌酶的变体。在另一个实施方案中，溶菌酶变体包含与SEQ ID NO:3具有至少75%同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，溶菌酶变体是烟曲霉(Aspergillus fumigatus)溶酶体的变体。本专利技术的变体具有与亲本溶菌酶相比较改变的性质，例如改变的温度依赖性活性谱，例如改善的热活性或者在低或中等温度改善的活性(嗜冷或嗜温活性)、改善的温度稳定性、改善的PH活性、改善的pH稳定性和/或对蛋白酶降解增加的抗性。本专利技术还涉及包含本专利技术的溶菌酶变体的抗微生物组合物和抗微生物方法。在实施方案中，本专利技术还涉及本专利技术的变体在动物饲料、干酪生产、食品保存、去污剂、口腔护理、美容学和皮肤病学中的用途。 附图简述图I是下述多种成熟的家族25溶菌酶氨基酸序列的比对烟曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:3)；烟曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:4)；费氏曲霉(Aspergillusfischerianus)溶菌酶(SEQ ID NO:5)；棒曲霉(Aspergillusclavatus)溶菌酶(SEQ ID NO:6)；米曲霉(Aspergillusoryzae)溶菌酶(SEQ ID NO:7)；土曲霉(Aspergillus terreus)溶菌酶(SEQ ID NO:8)；费氏曲霉溶菌酶(SEQ ID NO:9)；烟曲霉溶菌酶(SEQID NO: 10)；棒曲霉溶菌酶(SEQID NO: 11)；土曲霉溶菌酶(SEQ ID NO: 12);和马尔尼菲青霉(Penicillummarneffei)溶菌酶(SEQ ID NO: 13)。信号肽已使用程序Signal P版本3. O进行预测。信号肽不在比对中。图2列出了烟曲霉溶菌酶的三维结构的原子坐标。专利技术详述本专利技术涉及溶菌酶变体，尤其是属于糖基水解酶家族25 (GH25)的溶菌酶的变体，其包含优选以在一个或多个(几个)位置上的取代和/或插入和/或缺失形式的改变，其中所述位置的编号对应于SEQ ID N0:3的位置的编号。本专利技术的变体具有抗微生物和/或溶菌酶活性。定义抗微生物活性术语“抗微生物活性”在本文中定义为杀死或抑制微生物例如藻类、古细菌、细菌、真菌或原生动物的生长的活性。抗微生物活性可以是例如杀细菌的(意味着细菌的杀死)、抑菌的(意味着细菌生长的预防、或孢子形成的预防)。为了本专利技术的目的，抗微生物活性根据“材料与方法”部分中所述的溶菌酶浊度活性测定进行测定。溶菌酶活性术语“溶菌酶活性”在本文中定义为肽聚糖N-乙酰胞壁酰水解酶活性(EC 3.2. I. 17)，催化在肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的和在壳糊精中的N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1，4-β -键的水解。为了本专利技术的目的，溶菌酶活性根据“材料与方法”部分中所述的溶菌酶浊度活性测定进行测定。变体术语“变体”在本文中定义为包含改变的具有抗微生物活性和/或溶菌酶活性的多肽，所述改变例如在一个或多个(几个)特定位置上的一个或多个(几个)氨基酸残基的取代、插入和/或缺失，所述位置对应于SEQ ID N0:3中的氨基酸位置。改变的多肽(变体)可以通过人为干预经由修饰编码亲本酶的多核苷酸序列而获得。亲本酶可以由SEQID NO: I或这样的序列编码,所述序列与这些序列之一至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同，且编码具有抗微生物和/或溶菌酶活性的多肽。变体多肽序列优选是不能存在于自然界中的那种。野生型酶术语“野生型”溶菌酶指示由天然存在的生物表达的溶菌酶，优选来自天然存在的微生物，例如在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：L德玛利亚，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：
国别省市：