膀胱癌的诊断方法技术

本发明专利技术涉及诊断患者的膀胱癌的方法，其包括确定来自患者的DNA中的甲基化可变位置(MVP)的甲基化状态，并基于甲基化状态数据提供诊断。本发明专利技术还涉及治疗膀胱癌的方法，其包括通过本文限定的诊断方法提供膀胱癌的诊断，然后给予患者一种或多种抗癌试剂。本发明专利技术还涉及包含针对本文限定的MVP的探针的甲基化识别性阵列和包括所述阵列的试剂盒。

The diagnosis of bladder cancer

The present invention relates to a method for the diagnosis of a patient's bladder cancer, which includes determining methylation status of the methylation variable position (MVP) in the DNA from the patient and providing diagnosis based on methylation status data. The present invention also relates to a method for the treatment of bladder cancer, which includes the diagnosis of bladder cancer by the diagnostic method defined in this article, and then one or more anticancer agents are given to the patient. The invention also relates to a methylation recognition array comprising probes for the MVP defined herein and a kit comprising the array.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】膀胱癌的诊断方法
本专利技术涉及诊断患者中的膀胱癌的方法，其包括确定来自患者的DNA中的甲基化可变位置(MVP)的甲基化状态，并基于甲基化状态数据提供诊断。本专利技术还涉及治疗膀胱癌的方法，其包括通过本文限定的诊断方法提供膀胱癌的诊断，然后给予患者一种或多种抗癌剂。本专利技术还涉及包含针对本文限定的MVP的探针的甲基化识别性阵列和包括所述阵列的试剂盒。
技术介绍
膀胱癌是西方世界最常见的恶性肿瘤之一，在美国排名第五位的最常见的癌症并导致所有癌症相关死亡的约3％[1，2]。出现的最主要的临床症状是血尿，在所调查的所有这样的病例的约10％中检出膀胱癌[3]。膀胱癌更可能发生于老年男性患者、现在或过去的吸烟者和接触工业致癌物的患者[4]。患有不可见血尿的年轻女性较不可能携带膀胱癌，对于这些患者而言，在误诊血尿后膀胱癌检测延误是一件常见的事[5]。膀胱镜检查是目前检测膀胱癌的黄金标准，是需要诊所或医院出诊并且具有较小但显著的感染风险的一种侵入性、不舒服的手术[6-9]。在英国每年大约有10300人被诊断为膀胱癌并且5000人死于膀胱癌。然而，每年有超过100000个病例被从初级保健转诊到泌尿外科血尿诊所进行膀胱镜检查和影像检查。所转诊的患者中仅10％被检出膀胱癌。在那些确诊病例中，三分之二是非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)，其中70％会复发，15％会进展为肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。通过膀胱镜检查进行监督是检测复发所必需的，并且对于处于高复发风险的病例，实施频率为每3个月复查一次持续2年，然后每6个月复查一次，之后每年复查一次。血尿的研究及随后针对复发的监督造成估计为￡5539万的高额的健康经济费用，使得膀胱名列治疗起来的最昂贵的癌症之一[10，11]。因此，非常需要可以更好地鉴定患有疾病的患者并减少对不必要的膀胱镜检查的需求的改进的测定法。还没有基于尿的生物标记物被FDA批准作为膀胱癌检测的独立测试，因此，指导方针向所有患有可见血尿和持续性不可见血尿的患者推荐膀胱镜检查[10，11]。尿液细胞学常被用作膀胱镜检查的诊断辅助手段，但对高等级疾病和原位癌以外的其他癌症检测敏感性较低，不能代替膀胱镜检查[12，13]。同样，商业上可得的基于单个靶标或小的靶标组的测定法不能以足够的敏感性检测膀胱癌，并且只被批准与膀胱镜检查结合使用[14]。目前，一些研究已经表明，体液中的DNA甲基化生物标记物用于癌症的非侵入性检测的潜在效用，所述体液包括尿液[15-23]、血浆/血清[24-26]以及唾液[27，28]。DNA甲基化的变化在恶性转化中起关键作用，导致肿瘤抑制基因的沉默和癌基因的过表达[29]。DNA甲基化的个体发育可塑性和相对稳定性使得外遗传改变成为用于诊断的理想生物标记物。涉及在排泄的尿液中特定蛋白质的存在的检测测定法已被开发并商业化。在这些情况下，每次测定中检测的蛋白质的数量低，特异性和敏感性仍令人不满意[14]。所检测的蛋白质生物标记物包括人补体因子H相关蛋白、癌胚抗原(CEA)、膀胱肿瘤细胞相关的粘蛋白和核有丝分裂器蛋白22(NMP22)。就评价某些蛋白质的表达的测定而言，WO2014042763描述了用于检测尿液样品中的蛋白、由IL-8、MMP-9、SDC1、CCL18、SERPINE1、CD44、VEGF-A、CA9和ANG组成的九-生物标记物组；由CA9、CCL18、MMP12、TMEM45A、MMP9、SEMA3D、ERBB2、CRH和MXRA8组成的另一个9-生物标记物组；以及由CCL18、CD44和VEGF-A组成的三-生物标记物组。迄今为止，用于检测膀胱癌的DNA甲基化生物标记物检测已经集中在仅对少量基因座的分析，部分是由于技术限制和具有癌症特异性的靶标的衍生[11-19]。一般而言，所报道的敏感性和特异性相对于已建立的测定来说是高的，但仍不能获得通过膀胱镜检查所达到的性能特征。先前研究的针对膀胱癌的甲基化标记物包括DAPK、BCL2、TERT、TWIST1、NID2、RARβ、E-钙粘蛋白和p16。国际专利申请公开WO2013/144362描述了一种用于膀胱癌的诊断测定法，其涉及检测ECRG4和/或ITIH5基因的启动子的甲基化。美国专利申请公开US2013224738描述了一种用于膀胱癌的诊断测定法，其涉及评估由BCL2、CDKN2A和NID2组成的基因的甲基化状态。寻求用于准确诊断膀胱癌的改进的测定法，这样的测定法将具有重要的临床和经济益处，特别是非侵入性的测定法。专利技术概述提供了具有可靠且高的敏感性和特异性的诊断方法，其可以从生物样品(特别是排泄的尿液样品)中检测膀胱癌，并且其有潜能减少在血尿患者中和进行疾病复发监测的患者中对膀胱镜检查的需求。避免膀胱镜检查将降低膀胱癌治疗的成本，并对患者的健康产生积极的影响，减少就诊次数和侵入性检查的不便。因此，本专利技术提供了以下内容：本专利技术提供了一种在个体中诊断膀胱癌的方法，其包括：(a)提供来自所述个体的样品的DNA；(b)确定选自以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的，其中该组包括至少25个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP；和(c)当(b)组的至少25个MVP是甲基化的时，在所述个体中诊断为膀胱癌。在任一种这样的方法中，MVP组可包括至少40个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP，其中当至少25个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP是甲基化的时，诊断为膀胱癌。MVP组可包括至少50个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP，或可包括至少100个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP。MVP组可包括全部150个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP。在上述方法中，当选自以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP的至少40个MVP是甲基化的时，或当选自以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP的至少50个MVP是甲基化的时，或当至少100个MVP是甲基化的时，或当全部150个MVP是甲基化的时，可以在个体中诊断为癌症。在上述方法中，其中确定为是甲基化的MVP可包括以SEQIDNO1至3标识并由[CG]指示的MVP，或者可包括以SEQIDNO1至5标识并由[CG]指示的MVP，或者可包括以SEQIDNO1至10标识并由[CG]指示的MVP，或者可包括以SEQIDNO1至40标识并由[CG]指示的MVP。在上述方法中个，MVP组可包括全部150个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP，其中当选自以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP的至少40个MVP是甲基化的时，在个体中诊断为膀胱癌，且其中确定是甲基化的MVP包括以SEQIDNO1至10标识并由[CG]指示的MVP。在任一种上述方法中，其中确定每一个MVP是否均是甲基化的步骤可包括亚硫酸氢盐转化DNA。在任一种上述方法中，确定每一个MVP是否均是甲基化的步骤可包括：1)进行测序步骤以确定MVP的序列；2)将DNA与包含探针的阵列杂交，所述探针能够区分MVP的甲基化和非甲基化形式，将检测系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在个体中诊断膀胱癌的方法，其包括：(a)提供来自所述个体的样品的DNA；(b)确定选自以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的，其中该组包括至少25个以SEQ ID NO 1至150标识并由[CG]指示的MVP；和(c)当(b)组的至少25个MVP均是甲基化的时，在所述个体中诊断为膀胱癌。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.24 GB 1511152.91.一种在个体中诊断膀胱癌的方法，其包括：(a)提供来自所述个体的样品的DNA；(b)确定选自以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的，其中该组包括至少25个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP；和(c)当(b)组的至少25个MVP均是甲基化的时，在所述个体中诊断为膀胱癌。2.权利要求1的方法，其中所述MVP组包括至少40个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP，并且其中当至少25个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP均是甲基化的时，诊断为膀胱癌。3.权利要求2的方法，其中所述MVP组包括至少50个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP，或包括至少100个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP。4.权利要求3的方法，其中所述MVP组包括全部150个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP。5.权利要求2至4中任一项的方法，其中当选自以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP的至少40个MVP均是甲基化的时，或当选自以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP的至少50个MVP均是甲基化的时，或当选自以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP的至少100个MVP均是甲基化的时，或当全部150个MVP均是甲基化的时，在个体中诊断为膀胱癌。6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述确定为是甲基化的MVP包括以SEQIDNO1至3标识并由[CG]指示的MVP，或者包括以SEQIDNO1至5标识并由[CG]指示的MVP，或者包括以SEQIDNO1至10标识并由[CG]指示的MVP，或者包括以SEQIDNO1至40标识并由[CG]指示的MVP。7.权利要求1的方法，其中所述MVP组包括全部150个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP，其中当选自以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP的至少40个MVP是甲基化的时，在个体中诊断为膀胱癌，且其中所述确定是甲基化的MVP包括以SEQIDNO1至10标识并由[CG]指示的MVP。8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述确定每一个MVP是否均是甲基化的步骤包括亚硫酸氢盐转化所述DNA。9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述确定每一个MVP是否均是甲基化的步骤包括：1)进行测序步骤以确定MVP的序列；2)将DNA与包含探针的阵列杂交，所述探针能够区分MVP的甲基化和非甲基化形式，将检测系统应用于所述阵列以区分MVP的甲基化和非甲基化形式；或3)使用甲基化特异性引物进行扩增步骤，其中通过存在或不存在扩增产物来确定MVP的状态为甲基化的或非甲基化的。10.权利要求9(a)或9(b)的方法，其中在测序或杂交步骤之前进行扩增步骤，其中扩增包含每个MVP的基因座。11.权利要求9(c)或权利要求10的方法，其中所述扩增步骤是通过PCR进行的。12.权利要求10或权利要求11的方法，其中在测序或杂交步骤之前，进行捕获步骤，其中所述捕获步骤包括将包含MVP基因座的多核苷酸与对MVP基因座具有特异性的结合分子结合，以及收集包含MVP基因座和结合分子的复合物；且其中：i.所述捕获步骤发生在亚硫酸氢盐转化DNA的步骤之前；ii.所述捕获步骤发生在亚硫酸氢盐转化DNA的步骤之后但在扩增或杂交步骤之前；或iii.所述捕获步骤发生在亚硫酸氢盐转化DNA的步骤之后且在扩增步骤之后。13.权利要求12的方法，其中所述结合分子是对每个MVP具有特异性的寡核苷酸，优选每一个均具有与相应的MVP互补的序列的DNA或RNA分子。14.权利要求11至13中任一项的方法，其中所述结合分子与纯化部分偶联。15.权利要求14的方法，其中所述纯化部分包含第一纯化部分，所述收集包含MVP基因座和结合分子的复合物的步骤包括将所述第一纯化部分与包含第二纯化部分的物质结合，其中第一纯化部分和第二纯化部分形成相互作用复合物。16.权利要求15的方法，其中所述第一纯化部分是生物素，所述第二纯化部分是链亲和素；或其中第一纯化部分是链亲和素，所述第二纯化部分是生物素。17.权利要求10至16中任一项的方法，其中所述扩增包含MVP的基因座的步骤包括使用独立于MVP甲基化状态的引物。18.权利要求3至17中任一项的方法，其中所述扩增包含MVP的基因座的步骤通过微滴PCR扩增进行。19.前述权利要求中任一项的方法，其中获自个体的生物样品为尿液、血液、血清、血浆或无细胞DNA的样品。20.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法达到95％或更高的ROC敏感性和90％或更高的ROC特异性；优选ROC地敏感性为96％，ROC特异性为97％。21.权利要求1至19中任一项的方法，其中所述方法达到95％或更高的ROCAUC，优选98％。22.权利要求1至19中任一项的方法，其中所述方法达到95％或更高的阴性预测值(NPV)，优选97％。23.前述权利要求中任一项的方法，其中所述在个体中诊断膀胱癌的步骤还包括：i.对肿瘤等级进行分级；和/或ii.确定肿瘤复发的风险；和/或iii.确定非肌层浸润性疾病的进展的风险；和/或确定对治疗疗法的可能的反应。24.一种在个体中治疗膀胱癌的方法，其包括：(a)从来自个体的样品获得DNA，并确定选自以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的，其中该组包括至少25个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP；(b)当(a)组的至少25个MVP是甲基化的时，在个体中诊断为膀胱癌；和(c)给予所述个体一种或多种膀胱癌治疗。25.一种在个体中治疗膀胱癌的方法，其包括：(a)提供来自所述个体的样品的DNA，并确定选自以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的，其中该组包括至少25个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP；(b)当(a)组的至少25个MVP是甲基化的时，在个体中诊断为膀胱癌；和(c)给予所述个体一种或多种膀胱癌治疗。26.一种在个体中治疗膀胱癌的方法，其包括：(a)在来自所述个体的样品的DNA中确定选自以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的，其中该组包括至少25个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP；(b)当(a)组的至少25个MVP是甲基化的时，在个体中诊断为膀胱癌；和(c)给予所述个体一种或多种膀胱癌治疗。27.一种在个体中治疗膀胱癌的方法，其包括给予所述个体一种或多种膀胱癌治疗，其中所述个体已经通过以下步骤被诊断为患有膀胱癌：(a)提供来自所述个体的样品的DNA，并确定选自以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的，其中该组包括至少25个以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP；和(b)当(a)组的至少25个MVP是甲基化的时，在所述个体中诊断为膀胱癌。28.一种在个体中诊断膀胱癌的方法，其包括：(a)获得识别选自以SEQIDNO1至150标识并由[CG]指示的MVP的一组MVP中的每一个是否均是甲基化的数据，其中该组包...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·费博，J·凯莉，
申请(专利权)人：UCL商业有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB