一种胶质母细胞瘤标记物及其应用、试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种胶质母细胞瘤标记物METTL3及其应用。METTL3在胶质瘤细胞中显著高表达，且其表达高低与临床分级有显著相关性，在恶性程度最高的胶质母细胞瘤中表达最高；METTL3表达敲低可抑制胶质母细胞瘤细胞的生长，提示METTL3可以成为胶质母细胞瘤治疗的靶点。

A marker for glioblastoma and its application and kit

The invention discloses a glioblastoma marker METTL3 and its application. METTL3 is highly expressed in glioma cells, and the expression level has a significant correlation with the clinical classification, and the highest expression in glioblastoma with the highest malignancy. The low expression of METTL3 can inhibit the growth of glioblastoma cells, suggesting that METTL3 can be the target for the treatment of glioblastoma.

【技术实现步骤摘要】
一种胶质母细胞瘤标记物及其应用、试剂盒
本专利技术属于生物医药
，涉及一种与胶质母细胞瘤相关的组织肿瘤标记物及其应用。
技术介绍
胶质瘤是最常见的原发性颅内恶性肿瘤。儿童青少年好发，且进展迅速，病程短，较短时间内可累及脑干，病情凶险；成人病程长、进展慢，由于发展之初没有明显症状，到患者察觉时肿瘤已增大至侵犯相应脑区。而手术切除造成脑组织损伤，加之肿瘤难以切除干净和浸润生长的特点，胶质瘤往往预后不良。目前胶质瘤治疗采取以手术为主，放疗、化疗药物为辅的治疗手段。早期发现肿瘤、找到新的可行的治疗方法迫在眉睫，既往人们对胶质瘤发病等进行了一系列探讨，但仍存在已发现的标志物灵敏度不高、特异性不强等缺点。找到新的胶质瘤标志物和防治靶标具重要意义。胶质瘤有不同的分类标准，可分别按照细胞形态、肿瘤细胞的恶性程度和所处位置分类。临床最常用的是WHO制定的分级系统，根据这一分级系统将胶质瘤分为1-4级，级别越高，恶性程度越高，预后越差。其中程度最高的4级被称为胶质母细胞瘤。目前的治疗手段只能稍微延长患者的生存期，而且诊断也要综合病史、辅助诊断和术后病理学诊断等确认，因此发展新的治疗手段和诊断标记物成为胶质母细胞瘤防治的迫切需求。通过肿瘤标志物试剂盒，检测患者分子病理变化，做到早期筛查或辅助诊断，这就需要找到有效的肿瘤标记物。通过新的手段如基因治疗、免疫治疗进行胶质瘤特异性治疗则要求找到胶质母细胞瘤细胞的特异性标记。METTL3(NCBI登录号NM_019852.4，GeneID:56339)是一种对RNA进行甲基化修饰的酶，在人体组织中广泛表达，但其表达水平受到严格调控。在其他物种中的研究中表明METTL3缺陷会引起减数分裂或发育异常。
技术实现思路
本专利技术筛选出一种与胶质母细胞瘤相关的肿瘤标志物，METTL3基因。研究发现胶质瘤细胞METTL3异常高表达，且随着胶质瘤级别增加表达更显著，尤其是胶质母细胞瘤中表达最高；METTL3高表达与胶质母细胞瘤患者不良预后显著相关；用shRNA敲降METTL3表达显著抑制胶质母细胞瘤生长。提示METTL3可作为胶质瘤特别是胶质母细胞瘤的生物标记物和治疗靶点，并用于胶质母细胞瘤辅助诊断、疗效检测、预后判断和治疗，筛选治疗胶质母细胞瘤的药物。经检索，目前没有针对胶质母细胞瘤中METTL3的相关报道和专利申请。本专利技术进行了数据库挖掘工作，通过收集TCGA(TheCancerGenomeAtlas)胶质母细胞瘤数据库中完整的转录组数据和临床数据，以及利用收集到的胶质母细胞瘤临床切片样品分析基因的差异表达和部分临床病理学参数相关性。筛选数据完整的胶质母细胞瘤样本信息；分析胶质母细胞瘤METTL3基因表达差异；分析胶质母细胞瘤患者生存曲线。结果显示，胶质瘤患者中，METTL3的表达差异与肿瘤有着显著的相关性，不同级别的胶质瘤与正常组织相比METTL3均高表达，而且METTL3的表达量也随着肿瘤级别的增加而增加。本专利技术采用RT-PCR、免疫组化、基因敲降的方法验证癌症标志物的表达特征及其对胶质母细胞瘤细胞生长功能的影响。实验方法主要包括以下几个部分：1.应用RT-PCR技术在正常脑组织和胶质母细胞瘤样本中验证基因表达差异：提取胶质瘤及正常脑组织总RNA；设计引物，进行PCR反应；检测正常脑组织和胶质母细胞瘤样本中METTL3基因的表达变化。结果显示病例样本发现METTL3的高表达。2.在细胞水平验证该基因对胶质母细胞瘤细胞生长功能的影响：shRNA敲降基因表达；验证基因对细胞生长的影响。结果显示，敲降METTL3基因的胶质母细胞瘤细胞生长能力显著下降。3.在整体水平验证该基因对胶质瘤细胞生长功能的影响。结果显示，敲降METTL3基因的胶质瘤生长能力显著下降。METTL3基因可以作为胶质母细胞瘤标志物，用于胶质母细胞瘤诊断和预后判断，并且在研发胶质母细胞瘤靶向药物中有很好的应用前景。专利技术人发现，检测METTL3的引物具有良好的特异性，用于诊断胶质母细胞瘤具有很高的准确率。因此，本专利技术提供了一种胶质瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒。所述胶质瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断的试剂盒中包括METTL3基因的特异性引物，所述METTL3基因的特异性引物包含上游引物和下游引物，其中上游引物的序列如SEQIDNO.1所示，下游引物的序列如SEQIDNO.2所示。所述试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒和免疫组化检测试剂盒两种。其中实时荧光定量PCR检测试剂盒中引物适用于SYBRGreen的检测。另外，试剂盒中还包括标准DNA模板和PCR反应体系，PCR反应体系中的PCR反应液为实时荧光定量PCR反应液，并进一步包含荧光染料。所述实时荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及缓冲液，所述荧光染料为SYBRGreenII，Taq酶为热启动酶。免疫组化检测试剂盒包括标准品对照，METTL3抗体和免疫组化检测相关试剂。所述试剂盒的用法包括，从组织或细胞中获得测试样品；确定所述测试样品中生物标志物的表达水平；分析所述表达水平以产生风险评分，其中该风险评分可用于提供对象的分级诊断和预后。所述的测试样品是新鲜的、冷冻的或石蜡固定包埋的组织。所述参考值水平是METTL3基因在正常细胞即正常人脑组织细胞中的表达水平，所述正常细胞与测定细胞同一品系且无癌变，测定组织或细胞已知或被怀疑包含肿瘤细胞。附图说明图1为METTL3表达水平与胶质母细胞瘤患者生存曲线的关系。图2为TCGA数据库中METTL3在胶质瘤组织表达量与正常脑组织中的表达量比较(A)，RT-qPCR检测METTL3在胶质瘤临床样品与正常脑组织临床样品的表达量比较(B)，免疫组化所示METTL3在不同级别胶质瘤和正常脑组织的表达情况(C)。图3显示不同shRNA对胶质母细胞瘤细胞增殖能力的影响。分别表示进行METTL3敲降后对两种肿瘤细胞系的细胞生长数量改变(A)及shRNA干扰对裸鼠胶质瘤移植物生长的影响(B)及体积大小的差异(C)。具体实施方式下面结合附图与实施例对本专利技术作进一步的描述。实施例1:通过TCGA数据库的数据分析，挖掘METTL3基因表达与胶质母细胞瘤患者生存率的关系。采用TCGA标准方法下载两组胶质母细胞瘤组织样本的表达谱芯片数据和临床随访患者生存状态，利用统计软件做出METTL3表达水平与胶质母细胞瘤患者总生存率的关系图。结果：见图1，METTL3的表达与胶质母细胞瘤病人的存活率存在显著相关性，METTL3表达高的患者总生存率显著低于METTL3低表达的患者，提示METTL3很有可能具有促进癌症发展的作用。实施例2：通过数据库，挖掘METTL3表达与胶质瘤患者总生存率的关系。采用TCGA数据库下载胶质瘤患者的转录组RNA-seq测序数据，分析METTL3在不同样品中表达水平。结果：见图2A，分析发现与正常脑组织比较，METTL3在胶质瘤的表达水平显著增高，考虑可作为胶质瘤的早期诊断指标。实施例3：RT-qPCR验证METTL3基因在胶质瘤样品和正常脑组织中的表达差异。通过测定在正常脑组织细胞和胶质瘤患者肿瘤组织中的METTL3基因表达状态，对照组10例组织样品来自脑组织外伤患者，胶质瘤组织通过神经外科术切除获得并已得病理本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.METTL3基因作为胶质母细胞瘤肿瘤标志物的用途，其特征在于METTL3在胶质母细胞瘤中表达显著增高。

【技术特征摘要】
1.METTL3基因作为胶质母细胞瘤肿瘤标志物的用途，其特征在于METTL3在胶质母细胞瘤中表达显著增高。2.如权利要求1所述的METTL3基因在制备胶质母细胞瘤辅助诊断、疗效预测及预后判断试剂盒中的应用。3.一种胶质瘤检测试剂盒，其中包含检测METTL3表达的试剂，所述的检测METTL3表达的试剂是特异性检测METTL3mRNA的探针或引物，或者是特异性结合METTL3蛋白的抗体。4.如权利要求3所述的胶质瘤检测试剂盒，其中包含如SEQIDNO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵蔚，易旸，李福喜，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44