检测和定量次要变体的并行式方法技术

本文提供了用于检测具有低丰度变体和高丰度变体的多种靶核酸变体的存在与否和量的并行式方法。并行式方法。

【技术实现步骤摘要】
检测和定量次要变体的并行式方法
[0001]相关专利申请
[0002]本专利申请要求2015年4月25日提交的题为“检测和定量次要变体的并行式方法”，以Anders Nygren为专利技术人且以律师案卷号AGB
‑
6071
‑
PV指定的美国临时申请第62/152,698号的权益。另外，本申请涉及2012年7月17日提交的名为“用于并行式核酸鉴定的产品和方法”，以Christiane Honisch、Dirk J.Van Den Boom、Michael Mosko和Anders Nygren为专利技术人且以律师案卷号AGB
‑
6020
‑
CT2t指定的美国专利申请号13/551,486，其是2012年5月18提交的名为“用于并行式核酸鉴定的产品和方法”，以Christiane Honisch、Dirk Johannes Van Den Boom、Michael Mosko和Anders Nygren为专利技术人的国际专利申请号PCT/US2012/038710的继续申请。前述专利申请的全部内容通过引用纳入本文，包括其文本、表格和附图。


[0003]该技术部分涉及核酸鉴定方法，其中可以在一个过程中检测多重靶核酸。该技术还部分涉及核酸修饰的鉴定。

技术介绍

[0004]检测特异性核酸是诊断医学和分子生物学研究的重要工具。当前，核酸试验在例如鉴定感染生物体(如细菌和病毒)，探测正常基因的表达和鉴定突变基因(如致癌基因)，组织移植前针对相容性的组织分型，为法医学所进行的组织和血液样品匹配，以及对不同物种的基因进行同源性分析中起作用。

技术实现思路

[0005]在一些方面提供了用于检测多种核酸的变体存在与否的并行式方法，其包括制备(a)衍生自多种靶核酸或其部分的多种扩增子，其中各种靶核酸序列含有低丰度的变体和高丰度的变体。扩增子与多种寡核苷酸在单一反应中杂交从而生成杂交的寡核苷酸，各种寡核苷酸与靶核酸的扩增子各自特异性对应，其中(i)寡核苷酸与衍生自靶核酸的低丰度变体和高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5
’
位置处杂交，所述靶核酸低丰度变体的单碱基位置与所述高丰度变体的所述单碱基位置不同，(ii)多种靶核酸的各高丰度变体位于单碱基位置的核苷酸相同或不同，(iii)多种靶核酸低丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸都相同，并且(iv)多种靶核酸的高丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸与所述多种靶核酸的低丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸无一相同。将杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，所述延伸组合物包括针对低丰度变体特异性的终止核苷酸和针对一种或多种高丰度变体特异性的一个、两个或三个终止核苷酸；其中：(i)终止核苷酸包括捕获剂，(ii)针对高丰度变体特异性的一个、两个或三个终止核苷酸各自的浓度是相对于针对低丰度变体特异性的终止核苷酸浓度的0.1％至30％，(iii)延伸条件包括多重热循环，从而生成含有针对多种靶核酸的低丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸，和含
有针对多种靶核酸的高丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸。将延伸的寡核苷酸与固相在捕获剂与固相相互作用的条件下接触，从而在固相上捕获延伸的寡核苷酸，其中所述固相包括捕获剂的结合伴侣，并通过在升高的温度条件下将固相与竞争物接触，释放延伸的寡核苷酸，其中所述竞争物含有与固相相互作用的捕获剂的游离形式。检测释放的延伸的寡核苷酸；从而检测多种核酸的变体存在与否。
[0006]在某些方面还提供了一种包括一种或多种延伸的寡核苷酸的方法，所述延伸的寡核苷酸含有当含有针对低丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸未被检测到时，针对高丰度变体特异性的终止核苷酸作为假阴性结果的阳性对照。
[0007]在某些方面还提供了一种用于确定各种靶核酸相对于高丰度变体量的低丰度变体量的方法，其包括基于低丰度变体特异性终止核苷酸浓度和高丰度变体特异性终止核苷酸浓度之比的标准化。
[0008]下述说明、实施例、权利要求和附图中进一步描述某些实施方式。
[0009]附图简要说明
[0010]附图描述本技术的某些实施方式，但不具限制性。为了说明的清楚和方便，附图未按比例制作，并且在一些情况中，可能夸大或放大多个方面以协助对具体实施方式的理解。
[0011]图1示出了用于检测多种核酸的变体存在与否的并行式方法的一个实施方式的示意图。多重PCR后是单碱基延伸反应。该延伸反应由最少两个链终止核苷酸组成，其中一个靶向较多丰度变体(主要变体)，另一个靶向较少丰度变体(次要变体)。在延伸多种靶核酸的主要和次要变体的并行式反应中(未显示)，可以使用至多4个靶向任何可能的碱基组合的链终止核苷酸(低丰度变体的单一终止核苷酸和高丰度变体的1、2或3个不同的终止核苷酸)。以比靶向次要变体的链终止剂低的浓度提供靶向主要变体的链终止剂的浓度(大约是次要变体的链终止剂浓度的0.5％
‑
10％)。延伸反应利用标记了用于固相捕获的部分的特定链终止剂。捕获和洗涤之后，分析洗脱的产物的质量，并且使用MALDI
‑
TOF质谱分析法鉴定并表征靶核酸的主要和次要变体。通过将次要变体(突变体)信号与主要变体(野生型)信号的分数或比例值标准化进行定量。
具体实施方式
[0012]本文所述用于确定多种靶核酸存在与否的方法可由本领域普通技术人员(以下称为“普通技术人员”)找到多种用途。该方法可用于，例如：(a)快速确定样品中是否存在特定靶序列(例如，包含遗传变异的靶序列)；(b)进行混合物分析，例如鉴定混合物和/或其组合物或确定混合物中靶序列的频率(例如，混合群落，准种)；(c)检测样品中的序列变异(例如，突变，单核苷酸多态性)；(d)进行单倍型试验；(e)进行微生物(例如，病原体)分型；(f)检测样品中微生物靶序列的存在与否；(g)识别疾病标志物；(h)检测微卫星；(i)识别短串联重复；(j)识别一种或多种生物体；(k)检测等位变异；(l)确定等位基因频率；(m)确定甲基化模式；(n)进行表观遗传试验；(o)重新序列生物分子的区域；(p)在人类临床研究和医学中进行分析(例如，癌症标志物检测，序列变异检测；对特定药物给药有利或不利的序列特征的检测)，(q)进行HLA分型；(r)进行取证分析；(s)进行疫苗质量控制分析；(t)监测治疗；(u)进行矢量特征分析；(v)进行疫苗或生产菌株质量控制和(w)测试菌株特征(x)植物。这些方法也可以用于，例如，各种领域，包括但不限于商业，教育，医疗，农业，环境，疾病监
测，军事防御和法医领域。
[0013]本文所述方法提供了低浓度的针对延伸靶核酸的高丰度变体(主要变体)特异性的链终止剂，以及高浓度的针对延伸靶核酸的低丰度变体(次要变体)特异性的链终止剂。本文所述方法因此提供了针对假阴性结果的阳性对照，允许对低丰度变体进行定量，并且对检测低丰度变体(次要变体)的存在与否具有高灵敏度。将多种靶核酸分组，以使得相同的链终本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测多种核酸的变体存在与否的并行式方法，其包括：(a)制备衍生自多种靶核酸或其部分的多个扩增子，其中各种靶核酸包括低丰度变体和高丰度变体；(b)所述扩增子与多种寡核苷酸在单一反应中杂交从而生成杂交的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自与靶核酸的扩增子特异性对应，其中(i)寡核苷酸与衍生自靶核酸所述低丰度变体和所述高丰度变体的扩增子在单碱基位置的5
’
位置处杂交，所述靶核酸低丰度变体的所述单碱基位置与所述高丰度变体的所述单碱基位置不同，(ii)所述多种靶核酸各高丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸相同或不同，(iii)所述多种靶核酸各低丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸相同，并且(iv)所述多种靶核酸的高丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸与所述多种靶核酸中的低丰度变体位于所述单碱基位置的核苷酸无一相同；并且(c)将杂交的寡核苷酸与延伸组合物在延伸条件下接触，所述延伸组合物包括针对所述低丰度变体特异性的终止核苷酸和针对一种或多种所述高丰度变体特异性的1、2或3种终止核苷酸；其中：(i)所述终止核苷酸包括捕获剂，(ii)所述针对一种或多种高丰度变体特异性的1、2或3种终止核苷酸各自的浓度是相对于针对所述低丰度变体特异性的终止核苷酸浓度的0.1％至30％，(iii)所述延伸条件包括多重热循环，从而生成含有针对所述多种靶核酸的低丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸，和含有针对所述多种靶核酸的高丰度变体特异性的终止核苷酸的延伸的寡核苷酸；(d)将所述延伸的寡核苷酸与固相在所述捕获剂与所述固相相互作用的条件下接触，从而在所述固相上捕...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：基纳生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：