【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】无细胞DNA大小检测
交叉引用
[0001]本申请要求于2020年5月13日提交的美国临时申请号63/024,489、2020年7月21日提交的美国临时申请号63/054,617、2020年8月13日提交的美国临时申请号63/065,375，以及2020年10月28日提交的美国临时申请号63/106,741的权益，这些申请中的每一个通过引用整体并入本文。
技术介绍
[0002]无细胞核酸的检测和分析已成为研究个体健康的重要方法。例如，在患有癌症的个体中观察到无细胞核酸水平升高。此外，对孕妇的无细胞核酸的分析允许对胎儿染色体异常进行非侵入性产前筛查。
技术实现思路
[0003]本文提供了无细胞DNA大小检测和分析的方法。本文公开了一种方法，其中使用单链文库制备比双链文库制备具有更显著的大小差异。例如，使用单链DNA文库制备时，晚期癌症与健康者之间的片段大小差异可能为29bp，而使用双链制备时可能为12bp。
[0004]本文进一步公开了一种方法，其中在癌症与健康无细胞DNA之间的差异甲基化分子之间的大小差异更为显著。
[0005]在一个方面，本文提供了用于核酸分析的方法，包括：(a)从第一多个核酸分子制备第一单链脱氧核酸(DNA)文库，所述第一多个核酸分子包含源自对象的单链DNA和双链DNA；(b)从第二多个核酸分子制备第二单链DNA文库，所述第二多个核酸分子包含源自对照的单链DNA和双链DNA；(c)使用所述第一单链DNA文库来测量所述第一多个核酸分子的至少一子集的第一大小分布；(d)使用所述第...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于核酸分析的方法，包括：(a)从第一多个核酸分子制备第一单链脱氧核酸(DNA)文库，所述第一多个核酸分子包含源自对象的单链DNA和双链DNA；(b)从第二多个核酸分子制备第二单链DNA文库，所述第二多个核酸分子包含源自对照的单链DNA和双链DNA；(c)使用所述第一单链DNA文库来测量所述第一多个核酸分子的至少一子集的第一大小分布；(d)使用所述第二单链DNA文库来测量所述第二多个核酸分子的至少一子集的第二大小分布；(e)使用所述第一大小分布和所述第二大小分布来确定所述第一大小分布与所述第二大小分布之间的大小差异。2.根据权利要求1所述的方法，其中(a)包括使所述第一多个核酸分子变性。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中(b)包括使所述第二多个核酸分子变性。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中(a)包括使用对单链DNA有特异性的DNA连接酶将衔接子连接至所述第一多个核酸分子的个体单链DNA分子的5
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端、3
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端。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中(b)包括使用对单链DNA有特异性的DNA连接酶将衔接子连接至所述第二多个核酸分子的个体单链DNA分子的5
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端。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中(a)包括(i)环化所述第一多个核酸分子的个体单链DNA分子以形成第一多个环状核酸分子；和(ii)扩增所述第一多个环状核酸分子以产生第一多个扩增的核酸分子。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中(b)包括(i)环化所述第二多个核酸分子的个体单链DNA分子以形成第二多个环状核酸分子；和(ii)扩增所述第二多个环状核酸分子以产生第二多个扩增的核酸分子。8.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中环化包括将所述个体核酸分子的5
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端连接至所述个体核酸分子的3
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端。9.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中环化包括将衔接子偶联至所述个体核酸分子的3
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端两者。10.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述扩增通过具有链置换活性的聚合酶进行。11.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述扩增通过不具有链置换活性的聚合酶进行。12.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述扩增包括使所述个体核酸分子与包含随机引物的扩增反应混合物接触。13.根据权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述扩增包括使所述个体核酸分子与包含靶标特异性引物的扩增反应混合物接触。根据权利要求1所述的方法，还包括针对一个或多个靶序列富集所述第一多个核酸分子或所述第二多个核酸分子。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述富集是用一个或多个引物或捕获探针进行的。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述富集是用一个或多个抗体或其片段进行的。16.根据权利要求1所述的方法，其中测量所述第一单链DNA文库或所述第二单链DNA文
库的所述大小分布包括对所述第一单链DNA文库或所述第二单链DNA文库进行测序。17.根据权利要求16所述的方法，其中测序包括选自合成测序、连接测序、纳米孔测序、纳米球测序、离子检测、杂交测序、聚合群落(POLONY)测序、纳米网格滚环测序(ROLONY)和离子激流测序中的一种或多种的方法。18.根据权利要求1所述的方法，还包括将所述单链DNA文库或所述第二单链文库的个体核酸分子鉴定为具有基因组特征。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述基因组特征包括表观遗传修饰。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述表观遗传修饰选自甲基化、磷酸化、泛素化、苏素化、乙酰化、核糖基化、瓜氨酸化和片段化。21.根据权利要求18所述的方法，所述基因组特征包括拷贝数变异(CNV)、单核苷酸变异(SNV)、插入、缺失、易位或其组合。22.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多个核酸分子或所述第二多个核酸分子源自无细胞生物样品。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述无细胞生物样品包括体液。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述体液是尿液、唾液、血液、血清、血浆、泪液、痰液、脑脊液、滑液、黏液、胆汁、精液、淋巴液、羊水、月经液或其组合。25.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多个核酸包括肿瘤核酸。26.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二多个核酸源自健康对照。27.根据权利要求1所述的方法，其中当所述差异大于预定阈值时，确定所述对象有患上疾病的风险或患有疾病。28.根据权利要求1所述的方法，其中当所述第一大小分布的平均值小于所述第二大小分布的平均值时，确定所述对象有患上疾病的风险或患有疾病。29.根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中所述疾病是癌症。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述癌症选自结肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、肝细胞癌、肝癌、皮肤癌、恶性黑素瘤、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌和脑癌。31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，还包括向所述对象施用治疗剂。32.根据权利要求27至31中任一项所述的方法，还包括向所述对象推荐附加的癌症监测。33.根据权利要求27至32中任一项所述的方法，还包括使用所述差异来监测所述对象的所述疾病的进展或消退。34.一种用于核酸分析的方法，包括：(a)从多个核酸分子制备单链脱氧核酸(DNA)文库，所述多个核酸分子包含源自对象的单链DNA和双链DNA；(b)将所述单链DNA文库的个体核酸分子鉴定为具有基因组特征；(c)测量所述个体核酸分子的大小；(d)基于所述个体核酸分子的所述大小将所述基因组特征与疾病相关联。35.根据权利要求34所述的方法，其中(a)包括使所述多个核酸分子变性。36.根据权利要求34或权利要求35所述的方法，其中(a)包括使用对单链DNA有特异性的DNA连接酶将衔接子连接至所述多个核酸分子的个体单链DNA分子的5
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37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中(a)包括(i)环化所述多个核酸分子的个体单链DNA分子以形成多个环状核酸分子；和(ii)扩增所述多个环状核酸分子以产生多个扩增的核酸分子。38.根据权利要求37所述的方法，其中环化包括将所述个体核酸分子的5
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端连接至所述个体核酸分子的3
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端。39.根据权利要求37所述的方法，其中环化包括将衔接子偶联至所述个体核酸分子的3
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端两者。40.根据权利要求37所述的方法，其中所述扩增通过具有链置换活性的聚合酶进行。41.根据权利要求37所述的方法，其中所述扩增通过不具有链置换活性的聚合酶进行。42.根据权利要求37所述的方法，其中所述扩增包括使所述个体核酸分子与包含随机引物的扩增反应混合物接触。43.根据权利要求37所述的方法，其中所述扩增包括使所述个体核酸分子与包含靶标特异性引物的扩增反应混合物接触。44.根据权利要求34所述的方法，还包括针对一个或多个靶序列富集所述多个核酸分子。45.根据权利要求44所述的方法，其中所述富集是用一个或多个引物或捕获探针进行的。46.根据权利要求44所述的方法，其中所述富集是用一个或多个抗体或其片段进行的。47.根据权利要求34所述的方法，其中(b)包括对所述单链DNA文库进行测序。48.根据权利要求34所述的方法，其中(c)包括对所述单链DNA文库进行测序。49.根据权利要求47或权利要求48所述的方法，其中测序包括选自合成测序、连接测序、纳米孔测序、纳米球测序、离子检测、杂交测序、聚合群落(POLONY)测序、纳米网格滚环测序(ROLONY)和离子激流测序中的一种或多种的方法。50.根据权利要求34所述的方法，其中所述基因组特征包括表观遗传修饰。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述表观遗传修饰选自甲基化、磷酸化、泛素化、苏素化、乙酰化、核糖基化、瓜氨酸化和片段化。52.根据权利要求34所述的方法，其中所述基因组特征包括拷贝数变异(CNV)、单核苷酸变异(SNV)、插入、缺失、易位或其组合。53.根据权利要求34所述的方法，其中所述多个核酸分子源自无细胞生物样品。54.根据权利要求53所述的方法，其中所述无细胞生物样品包括体液。55.根据权利要求54所述的方法，其中所述体液是尿液、唾液、血液、血清、血浆、泪液、痰液、脑脊液、滑液、黏液、胆汁、精液、淋巴液、羊水、月经液或其组合。56.根据权利要求34所述的方法，其中所述多个核酸包括肿瘤核酸。57.根据权利要求34所述的方法，其中当所述个体核酸分子的平均大小低于预定阈值时，确定具有所述基因组特征的所述个体核酸分子与疾病相关联。58.根据权利要求34所述的方法，其中当具有所述基因组特征的所述个体核酸分子的平均大小小于没有所述基因组特征的核酸分子时，确定具有所述基因组特征的所述个体核酸分子与疾病相关联。59.根据权利要求34所述的方法，其中当具有所述基因组特征的所述个体核酸分子的
大小低于预定阈值时，确定所述对象有患上疾病的风险或患有疾病。60.根据权利要求34或权利要求57至59中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症。61.根据权利要求60所述的方法，其中所述癌症选自结肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、肝细胞癌、肝癌、皮肤癌、恶性黑素瘤、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、胰腺癌和脑癌。62.根据权利要求57至61中任一项所述的方法，还包括向所述对象施用治疗剂。63.根据权利要求57至62中任一项所述的方法，还包括向所述对象推荐附加的癌症监测。64.根据权利要求57至63中任一项所述的方法，还包括使用所述基因组特征或所述大小来监测所述对象的所述疾病的进展或消退。65.一种用于核酸分析的方法，包括：(a)从多个核酸分子制备单链脱氧核酸(DNA)文库，所述多个核酸分子包含源自对象的单链DNA和双链DNA；(b)将所述单链DNA文库的个体核酸分子鉴定为具有基因组特征；(c)鉴定所述个体核酸分子的至少5
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端；(d)基于所述个体核酸分子的所述5
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端，将所述基因组特征与疾病相关联。66.根据权利要求65所述的方法，其中(a)包括使所述多个核酸分子变性。67.根据权利要求65或权利要求66所述的方法，其中(a)包括使用对单链DNA有特异性的DNA连接酶将衔接子连接至所述多个核酸分子的个体单链DNA分子的5
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端。68.根据权利要求65至67中任一项所述的方法，其中(a)包括(i)环化所述多个核酸分子的个体单链DNA分子以形成多个环状核酸分子；和(ii)扩增所述多个环状核酸分子以产生多个扩增的核酸分子。69.根据权利要求68所述的方法，其中环化包括将所述个体核酸分子的5
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端连接至所述个体核酸分子的3
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端。70.根据权利要求68所述的方法，其中环化包括将衔接子偶联至所述个体核酸分子的3
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端和3
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端两者。71.根据权利要求68所述的方法，其中所述扩增通过具有链置换活性的聚合酶进行。72.根据权利要求68所述的方法，其中所述扩增通过不具有链置换活性的聚合酶进行。73.根据权利要求68所述的方法，其中所述扩增包括使所述个体核酸分子与包含随机引物的扩增反应混合物接触。74.根据权利要求68所述的方法，其中所述扩增包括使所述个体核酸分子与包含靶标特异性引物的扩增反应混合物接触。75.根据权利要求65所述的方法，还包括针对一个或多个靶序列富集所述多个核酸分子。76.根据权利要求75所述的方法，其中所述富集是用一个或多个引物或捕获探针进行的。77.根据权利要求65所述的方法，其中所述富集是用一个或多个抗体或其片段进行的。78.根据权利要求65所述的方法，其中(b)包括对所述单链DNA文库进行测序。79.根据权利要求65所述的方法，其中(c)包括对所述单链DNA文库进行测序。80.根据权利要求78或权利要求79所述的方法，其中测序包括选自合成测序、连接测
序、纳米孔测序、纳米球测序、离子检测、杂交测序、聚合群落(POLONY)测序、纳米网格滚环测序(ROLONY)和离子激流测序中的一种或多种的方法。81.根据权利要求65所述的方法，其中所述基因组特征包括表观遗传修饰。82.根据权利要求81所述的方法，其中所述表观遗传修饰选自甲基化、磷酸化、泛素化、苏素化、乙酰化、核糖基化、瓜氨酸化和片段...
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