一种甲状腺结节良恶性检测方法、试剂盒和应用技术

本发明专利技术提供了一种甲状腺结节良恶性检测方法、试剂盒和应用，涉及体外诊断技术领域。该方法包括基于高通量测序法的特异性检测基因变异情况；基因变异包括基因突变和基因融合，基因突变的检测基因包括BRAF基因、TERT基因；基因融合的检测基因包括RET基因、NTRK3基因。该方法和试剂盒能够同时完成DNA突变和RNA融合的检测，且单个样本的DNA核酸需求量可低至2ng，RNA核酸需求量可低至10ng，测序数据量可降低至0.2M reads以下，安全、准确、快速完成甲状腺结节的良恶性的鉴别，可以有效地辅助临床医生对甲状腺癌进行判断。医生对甲状腺癌进行判断。医生对甲状腺癌进行判断。

【技术实现步骤摘要】
一种甲状腺结节良恶性检测方法、试剂盒和应用


[0001]本申请涉及体外诊断
，尤其涉及一种甲状腺结节良恶性检测方法、试剂盒和应用。

技术介绍

[0002]甲状腺癌是内分泌系统和头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤，目前甲状腺癌已是发病率上升最快的恶性肿瘤。通常情况下，甲状腺癌多发生于甲状腺结节患者中，而甲状腺结节的患者数量众多，且绝大多数的甲状腺结节均是良性，因此如何快速并准确地对甲状腺结节的良恶性进行鉴别就显得尤为重要。
[0003]在甲状腺结节患者就诊过程中通常经过触诊以及B超检查进行初筛，最终通过穿刺活检，对甲状腺结节进行取样并通过细胞学检查来判断结节的良恶性。这一方法的最大局限在于，在细针穿刺活检取材样本中，有70％为良性结节，5％可确认为恶性结节，但剩余的20
‑
25％仍为不确定或可疑恶性。此外，即便对于明确诊断的甲状腺癌患者，治疗方式的选择以及预后情况也存在着较大差异。
[0004]在甲状腺结节的良恶性诊断过程中，对某些特定的基因变异或组合进行检测可以极大地帮助临床医生进行判断并指导后续临床决策。尤其是针对细针穿刺细胞病理分类为Bethesda III级(AUS/FLUS，意义不明确地细胞非典型病变/意义不明确的滤泡性病变)以及Bethesda IV级(FN/SFN，滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤)，需要对包括BRAF V600E突变、RET融合突变等在内的分子标志物进行检测。在具体临床应用中，由于甲状腺肿瘤相关基因突变分布呈现“长尾效应”，即主要的热点突变种类较少，但稀有突变种类较多，且不同变异可能指向不同的临床意义，因此选择合适的基因变异或组合进行检测就显得尤为重要，如果所检测的位点不合适，非但不能提高诊断的准确性，可能还会带来不必要的假阳性或假阴性情况。综上，在实际应用过程中需要综合考虑不同突变或变异的发生率及其临床意义，确定最优的组合，用于甲状腺结节良恶性的鉴别诊断。
[0005]基因检测是一种新的基于分子生物学的诊断方法，从细针穿刺活检组织样本中提取核酸并通过扩增法富集目标序列，然后对多重PCR扩增产物进行消化，随后加入特定DNA序列的测序标签和接头进行连接，经纯化后得到测序文库；对测序文库测序，得到DNA序列；经过过滤、比对等生物信息学分析，采用ClinVar数据库进行变异注释。根据基因检测所检测到的变异，可以有效地弥补细胞学活检的不足，辅助甲状腺结节良恶性的鉴别，并为甲状腺癌的治疗方式选择以及预后评估提供参考。现行甲状腺癌相关基因突变检测的方法有：
[0006](1)ARMS
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PCR方法
[0007]概念：突变扩增系统(amplification refractory mutation system,ARMS)又称等位基因特异性扩增法(allele specific amplification,ASA)，是Newton等首先建立用来检测已知突变的方法。
[0008]ARMS
‑
PCR原理：
[0009]TaqDNA聚合酶缺少3
’‑5’
外切酶活性，在一定条件下PCR引物3
’
末端的错配导致产
物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。
[0010]ARMS
‑
PCR优缺点
[0011]优点：灵敏度高，数据分析要求低。
[0012]缺点：单点检测，覆盖甲状腺基因检测位点不全，组合检测工作量增加，试剂成本高。
[0013](2)杂交捕获法测序
[0014]概念：杂交捕获法测序：探针设计，探针与目的基因杂交，纯化得到富集的目标DNA片段；构建相应文库，进行高通量测序
[0015]杂交捕获法测序原理：
[0016]是利用DNA碱基互补配对的原理，进行目标区域的探针设计，探针与目的DNA序列杂交，纯化得到富集的目标DNA片段；构建相应测序文库，进行高通量测序，通常高通量测序使用Illumina测序仪，文库随机连接到固相基质上，经过Bst聚合酶延伸和甲酸胺变性的桥PCR循环，生成大量的DNA簇(DNA cluster)，每个DNA簇中约有1000个相同序列的DNA片段，DNA簇与单链扩增产物的通用序列杂交，由于终止剂的作用，DNA 聚合酶每次循环只延伸一个dNTP。每次延伸所产生的光信号被标准的微阵列光学检测系统分析测序，下一次循环中把终止剂和荧光标记基团裂解掉，然后继续延伸dNTP，进行边合成边测序。
[0017]杂交捕获法测序优缺点
[0018]优点：大规模测序，相对全基因测序成本低。
[0019]缺点：产生数据量大，虽然相对全基因测序成本低，但整体试验成本依然较高，操作复杂，实验周期较长通常需要4
‑
5天得到结果。
[0020]关于甲状腺癌的遗传机制很复杂，随着技术的发展，研究发现其中既有DNA突变，也有RNA融合(基因融合)。ARMS
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PCR技术仅能单点检测DNA突变，且检测种类不全，存在局限性，另外，甲状腺细针穿刺活检取材较少，所纯化得到核酸总量有限，通常只能单独进行DNA检测中有限位点检测，无法同时满足更多的DNA突变点检测，以及RNA融合检测，不能满足临床检测需求。杂交捕获法测序技术，使高通量测序技术虽然能够满足DNA突变和基因融合，但由于测序数据量需要比较多，依然成本较高，且操作复杂，实验周期较长。
[0021]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0022]目前尚未有基于多重PCR技术对甲状腺结节良恶性检测同时进行DNA突变和RNA融合检测的产品，其主要难点在于：一方面，绝大多数多重PCR技术单独以DNA为模板进行多重PCR，而检测基因融合需要以RNA为模板起始，经逆转录得到cDNA并以cDNA作为模板进行额外的多重PCR，这样增加了工作量的同时也增加了成本；另一方面，甲状腺结节良恶性检测相关的基因突变位点较多，部分位点高GC含量或高重复序列，使得引物设计变得困难，而多重PCR引物对在同一反应体系内工作，引物互相干扰，使得部分引物对扩增性能不足，这也是多重PCR技术检测相关基因的难点之一。此外，甲状腺结节细针穿刺活检所得样本数量很少，提取所得核酸的量通常不足以支持多个基因位点的检测，这也是目前相关应用的一个难点。
[0023]为了克服现有技术中所存在的问题，本专利技术的目的在于提供基于高通量测序法的甲状腺结节良恶性相关多基因突变检测方法、试剂盒和应用。
[0024]为了实现上述目的以及其他相关目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0025]一方面，本申请提供了一种基于高通量测序法的甲状腺结节良恶性检测方法，所述检测方法包括基于高通量测序法特异性检测基因变异情况；
[0026]所述基因变异包括基因突变和基因融合，所述基因突变的检测基因包括BRAF基因、TERT基因；所述BRAF基因突变检测位点包括：c.1799T&本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于高通量测序法的甲状腺结节良恶性检测方法，其特征在于，所述检测方法包括基于高通量测序法特异性检测基因变异情况；所述基因变异包括基因突变和基因融合，所述基因突变的检测基因包括BRAF基因、TERT基因；所述BRAF基因突变检测位点包括：c.1799T>Ap.Val600Glu；所述TERT基因突变检测位点包括：c.1
‑
124C>T，c.1
‑
146C>T；所述基因融合的检测基因包括RET基因、NTRK3基因；所述RET基因融合检测位点包括：RET(12)
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CCDC6(1)，RET(12)
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NCOA4(8)；所述NTRK3基因融合检测位点包括：NTRK3(14)
‑
ETV6(4)。2.一种甲状腺结节良恶性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性检测基因变异情况的试剂；所述基因变异包括基因突变和基因融合，所述基因突变的检测基因包括BRAF基因、TERT基因；所述BRAF基因突变检测位点包括：c.1799T>Ap.Val600Glu；所述TERT基因突变检测位点包括：c.1
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124C>T，c.1
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146C>T；所述基因融合的检测基因包括RET基因、NTRK3基因；所述RET基因融合检测位点包括：RET(12)
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CCDC6(1)，RET(12)
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NCOA4(8)；所述NTRK3基因融合检测位点包括：NTRK3(14)
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ETV6(4)。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性检测基因变异情况的试剂包括DNA PCR引物、RNA PCR引物，所述DNA PCR引物包括BRAF基因突变检测引物对、TERT基因突变检测引物对；所述RNA PCR引物包括基因融合检测引物，所述基因融合检测引物包括RET基因融合检测引物对、NTRK3基因融合检测引物对；所述RNA PCR引物还包括用于判断PCR扩增反应是否正常进行的基因融合质控参照引物，所述基因融合质控参照引物包括：HMBS基因扩增引物对、ITGB7基因扩增引物对、TBP基因扩增引物对、MYC基因扩增引物对、LMNA基因扩增引物对。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述BRAF基因突变检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物；所述TERT基因突变检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的反向引物；所述RET基因融合检测引物对包括RET基因融合第一检测引物对、RET基因融合第二检测引物对，所述RET基因融合第一检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的反向引物；所述RET基因融合第二检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的反向引物；所述NTRK3基因融合检测引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的反向引物；所述MYC基因扩增引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的反向...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱旻，周璐，宋晨雪，李扬，刘蕊，
申请(专利权)人：江苏鹍远生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：