用于形成连接产物的方法和组合物技术

在一些方面，本公开内容提供了用于形成包含单链多核苷酸的连接产物的方法。由本公开内容的各个方面形成的连接产物可用于各种应用，包括但不限于序列分析。在一些实施方案中，所述连接产物包含无细胞多核苷酸。在一些方面，本公开内容提供了与本文方法一致的反应混合物、试剂盒和复合体。试剂盒和复合体。试剂盒和复合体。

【技术实现步骤摘要】
用于形成连接产物的方法和组合物
本申请是申请日为2016年12月02日、申请号为201680081032.6、专利技术名称为“用于形成连接产物的方法和组合物”的中国专利申请(其对应PCT申请的申请日为2016年12月02日、申请号为PCT/US2016/064853)的分案申请。交叉引用
[0001]本申请要求于2015年12月3日提交的美国临时申请号62/262,883的权益，该美国临时申请通过引用并入本文。

技术介绍

[0002]形成多核苷酸连接产物可以具有多种用途，诸如检查靶多核苷酸、生成表达载体的分子克隆方法、cDNA文库构建以及作为扩增和测序反应的前置步骤。连接产物可以由双链核酸和单链核酸二者形成。双链核酸可以通过“黏端”连接或“平端”连接来进行连接。在黏端连接中，包含末端突出端的交错末端可以与连接配偶体杂交。在平端连接中，末端突出端不存在，并且成功的连接依赖于5
’
端和3
’
端的瞬态缔合。一般而言，平端连接比黏端连接效率低，并且可以应用各种优化如调整浓度、温育时间和温度来提高效率。还可以连接单链多核苷酸。然本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定包含多个无细胞DNA多核苷酸的核酸样品中的序列变体的方法，其包括：(a)形成多个连接产物，其中所述连接产物中的单独的成员通过将无细胞DNA多核苷酸与多核苷酸复合体的单链衔接子连接而形成，其中所述多核苷酸复合体包含与无细胞DNA多核苷酸杂交的捕获探针的第一区段和与单链衔接子杂交的所述捕获探针的第二区段，其中单独的衔接子包含独特的条形码序列；(b)将所述多个连接产物进行环化以产生多个环状靶多核苷酸；(c)生成多个多联体，其中所述多个多联体中的单独的多联体通过延伸根据序列互补性与靶多核苷酸杂交的第一引物而形成；(d)由所述多联体生成多个延伸产物，其中所述多个延伸产物中的单独的延伸产物通过延伸根据序列互补性与多联体杂交的第二引物而形成；(e)对多个所述延伸产物进行测序以产生测序读取；以及(f)当(i)在含有至少出现两次的序列差异的延伸产物的测序读取中检测到序列差异，并且(ii)所述序列差异在具有不同条形码序列的至少两个不同的测序读取中出现时，将测序读取与参考序列之间的序列差异鉴定为所述序列变体。2.一种用于鉴定包含多个无细胞DNA多核苷酸的核酸样品中的序列变体的方法，其包括：(a)形成多个连接产物，其中所述连接产物中的单独的成员通过将无细胞DNA多核苷酸与多核苷酸复合体的单链衔接子连接而形成，其中所述多核苷酸复合体包含与无细胞DNA多核苷酸杂交的捕获探针的第一区段和与单链衔接子杂交的所述捕获探针的第二区段；(b)将所述多个连接产物进行环化以产生多个环状靶多核苷酸，其中单独的环状靶多核苷酸包含(i)无细胞DNA多核苷酸的5
’
端与单链衔接子的3
’
端之间的第一接点，以及(ii)所述无细胞DNA多核苷酸的3
’
端与所述单链衔接子的5
’
端之间的第二接点；(c)生成多个多联体，其中所述多个多联体中的单独的多联体通过延伸根据序列互补性与靶多核苷酸杂交的第一引物而形成；(d)由所述多联体生成多个延伸产物，其中所述多个延伸产物中的单独的延伸产物通过延伸根据序列互补性与所述多联体杂交的第二引物而形成；(e)对多个所述延伸产物进行测序以产生测序读取；(f)当(i)在含有至少出现两次的序列差异的延伸产物的测序读取中检测到序列差异，并且(ii)所述序列差异在具有不同的第一接点和第二接点的至少两个不同的测序读取中出现时，将测序读取与参考序列之间的序列差异鉴定为所述序列变体。3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括在(b)中进行环化之前降解所述捕获探针。4.根据权利要求3所述的方法，其中降解所述捕获探针包括酶促降解所述捕获探针。5.一种用于扩增无细胞DNA的方法，其包括：(a)通过将无细胞DNA多核苷酸与多核苷酸复合体的单链衔接子连接来形成连接产物，其中所述多核苷酸复合体包含与无细胞DNA多核苷酸杂交的捕获探针的第一区段和与单链衔接子杂交的所述捕获探针的第二区段；(b)降解或选择性地去除所述捕获探针；
(c)将所述连接产物进行环化以产生环状靶多核苷酸；(d)通过延伸根据序列互补性与所述靶多核苷酸杂交的第一引物生成包含来自所述环状靶多核苷酸的单链多核苷酸的多联体；以及(e)通过延伸根据序列互补性与所述多联体杂交的第二引物生成包含一个或多个拷贝的所述靶多核苷酸的多个延伸产物。6.一种进行滚环扩增的方法，其包括：(a)提供包含靶多核苷酸的环状多核苷酸，其中所述环状多核苷酸通过以下步骤形成：(i)将无细胞DNA多核苷酸和单链衔接子与捕获探针混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁莉，林盛榕，马利克，
申请(专利权)人：安可济控股有限公司，
类型：发明
国别省市：