一种RNA建库方法及试剂盒技术

提供了一种RNA建库方法及其专用试剂盒。制备RNA文库的方法，包括如下步骤：提取RNA，进行打断；3'末端加尾；5'末端加接头，并与DNA探针混合物杂交；DNA探针混合物由若干条与预期去除的RNA反向互补的DNA探针组成；去除杂交链中的RNA并去除DNA；进行逆转录和PCR扩增，获得文库溶液。本发明专利技术结合了加polyA和5'Ligation。通过加polyA可以快速增加体系里RNA的含量，从而避免后续纯化损失。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种RNA建库方法及试剂盒
本专利技术涉及一种RNA建库方法及试剂盒。
技术介绍
包括NIPT(无创产前筛查)在内的无创检测既是十分经典的技术，也是当前新兴的领域。血浆或者血清酶学检测以及NIPT分别从蛋白质以及DNA水平对血浆/血清进行分析，从而推测身体健康状况或者妊娠情况。但是血浆/血清RNA的应用还刚刚起步，这主要受限于RNA本身不稳定的性质，血浆/血清RNA多是小片段，而且浓度很低，这种低质量低浓度RNA尚未有非常好的建库策略。当前RNA建库技术都是只针对长RNA或者短RNA，没有合适的技术同时针对长片段RNA和短片段RNA建库，如果希望同时研究，需要分别建库。RNaseH法建库，这是长片段RNA建库的经典方法。基本步骤为：和rRNA反向互补的DNAoligo和样本退火，用RNaseH去除rRNA，再用DNase去除DNAoligo；逆转录(cDNA一链合成)，二链合成；补平，加dA，接头连接，PCR。存在如下问题：流程十分繁琐，速度慢，实施难度较大；要求初始RNA量高；只能检测长片段RNA。SmallRNA建库。基本步骤为：连接3’Adaptor，再连接5’Adaptor，逆转录，PCR。存在如下问题：操作比较困难，速度慢，成本很高；要求初始RNA量高；只能检测短片段RNA；建库Bias严重。专利技术公开本专利技术提供了一种RNA建库方法及其专用试剂盒。本专利技术提供的第一种制备RNA文库的方法(方法1)，包括如下步骤：提取RNA，进行打断；3’末端加尾；r>5’末端加接头，并与DNA探针混合物杂交；所述DNA探针混合物由若干条与预期去除的RNA反向互补的DNA探针组成；去除杂交链中的RNA并去除DNA；进行逆转录和PCR扩增，获得文库溶液。所述方法1，优选的包括如下步骤：(1)提取RNA，进行打断；(2)3’末端加尾；(3)5’末端加接头，并与DNA探针混合物杂交；所述DNA探针混合物由若干条与预期去除的RNA反向互补的DNA探针组成；(4)去除杂交链中的RNA并去除DNA；(5)依次进行逆转录和PCR扩增，获得文库溶液。所述打断的实现方式为热处理。所述打断的目的是得到400nt以下的RNA片段。RIN>8时所述热处理的参数为：94℃、10分钟。5≤RIN≤8时所述热处理的参数为：90℃、5分钟。3≤RIN≤5时所述热处理的参数为：80℃、5分钟。RIN<3时所述热处理的参数为：65℃、5分钟。所述3’末端加尾的实现方式为：对RNA片段进行修饰，使其5’末端具有磷酸基团且3’末端具有羟基基团，然后进行加尾。“对RNA片段进行修饰，使其5’末端具有磷酸基团且3’末端具有羟基基团”的实现方法为：用T4PNK处理。所述加尾为增加poly(A)尾或poly(U)尾。去除杂交链中的RNA并去除DNA的实现方法为：依次进行RNaseH消化和DNase消化。所述提取RNA为提取CfRNA或提取总RNA。用于提取RNA的样本包括但不限于血浆、组织或细胞。本专利技术还保护一种制备RNA文库的方法(方法2)，包括如下步骤：提取RNA；3’末端加尾；5’末端加接头，并与DNA探针混合物杂交；所述DNA探针混合物由若干条与预期去除的RNA反向互补的DNA探针组成；去除杂交链中的RNA并去除DNA；进行逆转录和PCR扩增，获得文库溶液。所述方法2，优选的包括如下步骤：(1)提取RNA；(2)3’末端加尾；(3)5’末端加接头，并与DNA探针混合物杂交；所述DNA探针混合物由若干条与预期去除的RNA反向互补的DNA探针组成；(4)去除杂交链中的RNA并去除DNA；(5)依次进行逆转录和PCR扩增，获得文库溶液。所述加尾为增加poly(A)尾或poly(U)尾。去除杂交链中的RNA并去除DNA的实现方法为：依次进行RNaseH消化和DNase消化。所述提取RNA为提取CfRNA或提取总RNA。用于提取RNA的样本包括但不限于血浆、组织或细胞。本专利技术还提供了一种制备RNA文库的方法(方法3)，包括如下步骤：提取RNA，进行打断；3’末端加尾；5’末端加接头，并富集目标RNA片段；进行逆转录和PCR扩增，获得文库溶液。所述方法3，优选的包括如下步骤：(1)提取RNA，进行打断；(2)3’末端加尾；(3)5’末端加接头，并富集目标RNA片段；(4)依次进行逆转录和PCR扩增，获得文库溶液。所述打断的实现方式为热处理。所述打断的目的是得到400nt以下的RNA片段。RIN>8时所述热处理的参数为：94℃、10分钟。5≤RIN≤8时所述热处理的参数为：90℃、5分钟。3≤RIN≤5时所述热处理的参数为：80℃、5分钟。RIN<3时所述热处理的参数为：65℃、5分钟。所述3’末端加尾的实现方式为：对RNA片段进行修饰，使其5’末端具有磷酸基团且3’末端具有羟基基团，然后进行加尾。“对RNA片段进行修饰，使其5’末端具有磷酸基团且3’末端具有羟基基团”的实现方法为：用T4PNK处理。所述加尾为增加poly(A)尾或poly(U)尾。富集目标RNA片段的实现方法包括但不限于：芯片捕获、多重PCR或者兼并PCR等。所述提取RNA为提取CfRNA或提取总RNA。用于提取RNA的样本包括但不限于血浆、组织或细胞。本专利技术还保护一种制备RNA文库的方法(方法4)，包括如下步骤：提取RNA；3’末端加尾；5’末端加接头，并富集目标RNA片段；进行逆转录和PCR扩增，获得文库溶液。所述方法4，优选的包括如下步骤：(1)提取RNA；(2)3’末端加尾；(3)5’末端加接头，并富集目标RNA片段；(4)依次进行逆转录和PCR扩增，获得文库溶液。所述加尾为增加poly(A)尾或poly(U)尾。富集目标RNA片段的实现方法包括但不限于：芯片捕获、多重PCR或者兼并PCR等。所述提取RNA为提取CfRNA或提取总RNA。用于提取RNA的样本包括但不限于血浆、组织或细胞。以上任一所述杂交链为DNA和RNA的杂交链。以上任一所述RNA为人RNA。以上任一所述预期去除的RNA为rRNA和YRNA。以上任一所述DNA探针混合物由204种探针组成，依次如序列表的序列5至序列208所示。以上任一所述预期去除的RNA为rRNA。以上任一所述DNA探针混合物由195种探针组成，依次如序列表的序列5至序列199所示。以上任一所述接头如序列表的序列1所示。以上任一所述逆转录采用的逆转录引物如序列表的序列2所示。以上任一所述PCR采用两条引本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备RNA文库的方法，包括如下步骤：/n提取RNA，进行打断；/n3’末端加尾；/n5’末端加接头，并与DNA探针混合物杂交；所述DNA探针混合物由若干条与预期去除的RNA反向互补的DNA探针组成；/n去除杂交链中的RNA并去除DNA；/n进行逆转录和PCR扩增，获得文库溶液。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种制备RNA文库的方法，包括如下步骤：
提取RNA，进行打断；
3’末端加尾；
5’末端加接头，并与DNA探针混合物杂交；所述DNA探针混合物由若干条与预期去除的RNA反向互补的DNA探针组成；
去除杂交链中的RNA并去除DNA；
进行逆转录和PCR扩增，获得文库溶液。


如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述打断的实现方式为热处理。


如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述3’末端加尾的实现方式为：对RNA片段进行修饰，使其5’末端具有磷酸基团且3’末端具有羟基基团，然后进行加尾。


如权利要求3所述的方法，其特征在于：“对RNA片段进行修饰，使其5’末端具有磷酸基团且3’末端具有羟基基团”的实现方法为：用T4PNK处理。


如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：去除杂交链中的RNA并去除DNA的实现方法为：依次进行RNaseH消化和DNase消化。


一种制备RNA文库的方法，包括如下步骤：
提取RNA；
3’末端加尾；
5’末端加接头，并与DNA探针混合物杂交；所述DNA探针混合物由若干条与预期去除的RNA反向互补的DNA探针组成；
去除杂交链中的RNA并去除DNA；
进行逆转录和PCR扩增，获得文库溶液。


如权利要求6所述的方法，其特征在于：去除杂交链中的RNA并去除DNA的实现方法为：依次进行RNaseH消化和DNase消化。


一种制备RNA文库的方法，包括如下步骤：
提取RNA，进行打断；
3’末端加尾；
5’末端加接头，并富集目标RNA片段；
进行逆转录和PCR扩增，获得文库溶液。


一种制备RNA文库的方法，包括如下步骤：
提取RNA；
3’末端加尾；
5’末端加接头，并富集目标RNA片段；
进行逆转录和PCR扩增，获得文库溶液。


一种制备RNA文库的试剂盒，包括组件A、组件B、组件C、组件D、组件E和组件F；
组件A为用于RNA分子3’末端加尾的试剂或试剂组合；
组件B为用于RNA分子5’末端加接头的试剂或试剂组合；
组件C为DNA探针混合物；所述DNA探针混合物由若干条与预期去除的RNA反向互补的DNA探针组成；
组件D为去除杂交链中的RNA并去除DNA的试剂或试剂组合；
组件E为用于逆转录的试剂或试剂组合；
组件F为用于PCR的试剂或试剂组合。


一种制备RNA文库的试剂盒，包括组件A、组件G、组件D、组件E、组件F；
组件A为用于RNA分子3’末端加尾的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨熹，王文婧，邢彦如，徐金金，陈芳，朱师达，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44