【技术实现步骤摘要】
一种空间转录组测序数据的分析方法
本专利技术属于生物技术和生物信息
，具体涉及一种空间转录组测序数据的分析方法。
技术介绍
随着生物行业的技术进步，高通量测序技术在各领域研究中发挥了重要作用，但随着各领域研究的深入，仍有些问题传统高通量测序技术无法得到解决。这是由于传统组学技术收集离体的组织或者细胞进行高通量测序，技术在建库的过程中自然导致细胞在组织中原位置的不可还原性，也致使组织微环境、细胞联系无法还原。对于组织测序，(1)细胞微环境难以捕获，不同于大环境的研究，细胞本身的体积很小，细胞的微环境又是由细胞间的关联性构建的有机整体。虽然近几年来单细胞测序技术迅速成熟，但是单细胞转录组依然无法记录细胞间关联信息(单细胞悬液制备破坏了细胞的原始位置信息)，缺失了微环境的有序完整性。所以如何有效获得这个有效整体，一直是相关研究的难点之一；(2)细胞微环境研究手段有限，单细胞转录组空间序列分析的方法出现，再结合FISH验证，确实在很大程度上推进了细胞微环境的研究。但是，这种空间序列分析获得的数据有效性相对较低。细胞微环境对分子机理的研究有至关重要的推进作用，例如肿瘤微环境对肿瘤的发生、进程和抗药性都有重要影响，渐冻症也认为运动神经和神经胶质的交流受阻是重要的发病起因，作物根系发育同样也受到了内源性共生菌构建的微环境影响，因此急需快速挖掘细胞微环境分子特征的有效手段。对于空间转录组数据分析方面，因其组织测序的复杂性、数据量大和空间异质性的存在使得数据分析有很大的难度。而空间转录组作为新兴技术，技术...
【技术保护点】
1.一种空间转录组测序数据的分析方法，其特征在于，包括如下过程：/nS1、样本检测建库；/nS2、测序数据的生物信息分析。/n
【技术特征摘要】
1.一种空间转录组测序数据的分析方法，其特征在于，包括如下过程：
S1、样本检测建库；
S2、测序数据的生物信息分析。
2.如权利要求1所述的空间转录组数据生物信息分析方法，其特征在于，步骤S1包括如下过程：
(1)样本准备：将组织速冻后，使用OCT包埋剂对组织进行包埋，在低温环境下，使用冷冻切片技术从组织块上切取一张长、宽各10mm，10μm厚的切片分别贴附到组织优化芯片或文库制备芯片上，然后使用预冷甲醇固定切片，苏木精-伊红染色法对切片进行染色，组织染色结果通过明场显微镜记录组织形态和spot位置；
(2)组织优化：使用组织优化芯片对组织透化时间进行优化，首先，设置梯度透化时间向完成了明场成像的芯片添加组织透化液；然后在透化完成的芯片上进行荧光反转录，将成功捕获的mRNA反转录为带荧光标签的cDNA；反转录完成后，去除掉芯片上的组织；最后，使用荧光显微镜对芯片进行成像，依据荧光成像结果的亮度、弥散程度和组织透化时间选取最佳组织透化时间用于文库构建；
(3)文库制备：使用文库制备芯片进行空间转录组文库制备，将完成了明场成像的芯片按照最佳组织透化时间进行组织透化，释放组织mRNA与芯片上的捕获序列结合，逆转录合成cDNA片段并标记空间位置，PCR扩增合成cDNA二链，通过碱性环境使cDNA变性将cDNA二链释放到液体游离环境，以cDNA二链为模板进一步扩增合成大量cDNA，将cDNA酶切打断成200-300bp的片段，加上P5接头、i5样本索引、read2、i7样本索引和P7接头构建标准测序文库；
(4)文库测序：利用Illumina测序平台的双端测序模式对建好的文库进行高通量测序，在Read1端，包含了16bp的barcode信息和12bp的UMI信息用于确定转录本位置和表达量定量；在Read2端，包含了cDNA片段，用于参考基因组比对确定mRNA所对应的基因。
3.如权利要求1所述的空间转录组数据生物信息分析方法，其特征在于，步骤S2包括如下过程：
(1)测序数据质控及基因表达量定量；
(2)spots聚类分群分析；
(3)亚群特征基因分析；
(4)空间特征基因分析。
4.如权利要求3所述的生物信息分析方法，其特征在于，步骤S2中的过程(1)的具体操作如下：
①数据测序的基本质控：将测序原始数据输入spaceranger中，对spot位置进行比对获得覆盖在组织切片下的spot作为有效spot，结合芯片的序列号获得有效spot对应的barcode信息，基于有效barcode信息，对测序数据的reads质量、测序饱和度和有效barcode...
【专利技术属性】
技术研发人员：周煌凯，高川，陈飞钦，艾鹏，张秋雪，
申请(专利权)人：广州基迪奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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