本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种动物细胞核悬液的制备方法及其应用。本发明专利技术提供的制备方法包括组织处理破碎、重悬、离心、沉淀、重悬、细胞筛过滤、重悬离心，最后检测核浓度。本发明专利技术提供的动物细胞核悬液满足各类高通量单细胞测序平台的细胞悬液质量要求，有利于其进一步的推广应用。其进一步的推广应用。其进一步的推广应用。
【技术实现步骤摘要】
一种动物细胞核悬液的制备方法及其应用
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种动物细胞核悬液的制备方法及其应用。
技术介绍
[0002]细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞结构，是细胞遗传与代谢的控制中心，也是真核细胞区别于原核细胞最显著的标志之一。细胞核在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。尽管细胞核的形状有多种多样，但是它的基本结构却大致相同，主要由核被膜、染色质、核骨架、核仁及核体组成。
[0003]现有技术中，尚未发现专门的制备动物细胞核悬液的方法，一般都是直接制备动物细胞悬液，这是由于动物细胞核中包含染色质、核仁、核体等多种结构，还包含遗传物质DNA，在实际的细胞核悬液制备过程中，怎样保证上述物质的完整性，现有技术中并未找到解决方式。然而，在新一代高通量单细胞测序平台中，有些情况只能将组织制备成细胞核悬液才能进行测序，如细胞体积过大的组织，高能耗伴随的多线粒体的组织等。
[0004]现有技术中已知的细胞核悬液均是采用植物细胞核制备的，如中国专利CN103776678B公开了一种草莓细胞核悬液的制备方法，中国专利CN103940646B公开了一种红掌细胞核悬液的制备方法，中国专利申请CN103940656B公开了一种松萝凤梨细胞核悬液的制备方法，上述制备过程均是利用细胞提取液提取植物细胞核，并用尼龙网过滤制得，但是对于动物细胞核悬液的制备过程，现有技术中并没有提出。
[0005]综上可知，市场上亟需一种可以有效制备动物细胞核悬液的技术。
技术实现思路
[0006]针对现有技术普遍存在的缺陷，本专利技术创造性的提供了一种动物细胞核悬液的制备方法及其应用。本专利技术制备的动物细胞核悬液可以用于单细胞转录组测序文库的构建，有利于其进一步的推广应用。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0008]一种细胞核悬液的制备方法，包含如下过程：
[0009]S1、取45～55mg的目的组织，向其中加入450～550μL的裂解液，于冰上静置4～6min，然后将组织剪成1～3mm3大小的碎片，得含裂解液的组织碎片；
[0010]S2、将步骤S1制得的含裂解液的组织碎片转移至研磨管，迅速按压1～2次，并于冰上静置3～5min，制得组织液；
[0011]S3、将步骤S2制得的组织液按压8～12次，于冰上静置2～3min，再次按压14～16次，并迅速转移至新的离心管中，制得匀浆混合液；
[0012]S4、向步骤S3制得的匀浆混合液中加入450～550μL的重悬Buffer，来回颠倒5～8次，混合均匀，然后离心，将上清液转移至15mL离心管中，制得新的匀浆液；
[0013]S5、将步骤S4制得的新的匀浆液离心，去除上清液，加入1～2mL重悬buffer充分重悬沉淀，连续重复2次，然后向其中加入碘克沙醇，吹打混匀，并向其中加入700μL重悬
buffer，再次离心，并用移液枪去除杂质及上清液，保留下层液体；
[0014]S6、向步骤S5中的下层液体中加入1～2mL重悬buffer，轻柔吹吸混合均匀，然后离心去掉上清液，最后留180～220μL于离心管内，向其中加入450～550μL的重悬buffer，轻柔吹吸重悬，制得细胞悬液；
[0015]S7、将步骤S6制得的细胞悬液用细胞筛过滤，并向其中加入450～550μL的重悬buffer，离心，收集沉淀，然后用杀菌液清洗2次，离心，去掉上清液，向沉淀中加入预冷的1
×
PBS，并检测其浓度，即得。
[0016]优选地，步骤S1、S2所述的裂解液包括摩尔质量为250mM的蔗糖，摩尔质量为50mM的Tris
‑
HCl，摩尔质量为50mM的CaCl2，摩尔质量为50mM的MgCl2，摩尔质量为1mM的DTT，质量百分数为0.1％的CA
‑
630，酶活单位为0.4U/μL的RNase Inhibitor，质量浓度为0.04％的BSA，1
×
protease inhibitor。
[0017]优选地，步骤S4、S5、S6及S7中所述的重悬buffer为含质量百分数为0.04％的BSA，终浓度为0.35M的甘露醇，活性为0.2U/μL的RNase Inhibitor的1
×
PBS。
[0018]优选地，步骤S4所述的离心过程为于1600～1700rpm转速下离心8～12s。
[0019]优选地，步骤S5所述的离心过程为于2600～2700rpm转速下离心4～6min；所述碘克沙醇的质量百分数为55～65％，加入量为液体总体积的0.6～0.8倍；所述再次离心时转速为10000～12000rpm，离心时间为15～20min。
[0020]优选地，步骤S6所述的离心过程为于2600～2700rpm转速下离心5～8min。
[0021]优选地，步骤S7所述的离心过程为于2600～2700rpm转速下离心4～7min；所述杀菌液包含如下组分及其重量份数：金银花粉5～10份，大蒜素3～5份，连翘提取物2～3份，双纯水50～60份。
[0022]本专利技术还提供了一种利用所述的制备方法在构建单细胞转录组测序文库中的应用。
[0023]优选地，将利用所述方法制备的细胞悬液置于冰上，于30min内建库。
[0024]本专利技术中，将组织破碎后，采用自制的裂解液裂解细胞，留下细胞核，裂解液中含有RNase Inhibitor，可以抑制RNase的活性，防止RNA降解，与其他组分相互配合，保证细胞核的完整性。同时，本专利技术提供的制备方法中，在制成细胞沉淀后，还对细胞沉淀用杀菌液进行清洗，消除在制备悬液过程中可能出现的细菌、真菌污染。
[0025]此外，专利技术人在试验过程中，发现所有组织按照如下方式配制裂解液均可得到良好的效果：4070μL蔗糖+600μL Tris
‑
HCl+120μL CaCl2+180μL MgCl2+5μL DTT+5μL CA
‑
630+5μL RNase Inhibitor+10μL BSA+5μL 1
×
protease inhibitor；所述重悬buffer共配制5mL的1
×
PBS，其中还包含终浓度为质量百分数为0.04％的BSA，终浓度为0.35M甘露醇，最终酶活性为0.2U/μL RNase Inhibitor；所述BSA及甘露醇均用1
×
PBS混合，包含在5mL之内；在用1
×
PBS缓冲液稀释细胞核沉淀时，根据沉淀的量加入预冷的1
×
PBS，保证核浓度在800～1500个/μL。
[0026]与现有技术相比，本专利技术提供的动物细胞核悬液的制备方法具有如下优点：
[0027](1)本专利技术提供的制备方法，首次实现了动物细胞核悬液的制备；
[0028](2)本本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种细胞核悬液的制备方法，其特征在于，包含如下过程：S1、取45～55mg的目的组织，向其中加入450～550μL的裂解液，于冰上静置4～6min，然后将组织剪成1～3mm3大小的碎片，得含裂解液的组织碎片；S2、将步骤S1制得的含裂解液的组织碎片转移至研磨管，迅速按压1～2次，并于冰上静置3～5min，制得组织液；S3、将步骤S2制得的组织液按压8～12次，于冰上静置2～3min，再次按压14～16次，并迅速转移至新的离心管中，制得匀浆混合液；S4、向步骤S3制得的匀浆混合液中加入450～550μL的重悬Buffer，来回颠倒5～8次，混合均匀，然后离心，将上清液转移至15mL离心管中，制得新的匀浆液；S5、将步骤S4制得的新的匀浆液离心，去除上清液，加入1～2mL重悬buffer充分重悬沉淀，连续重复2次，然后向其中加入碘克沙醇，吹打混匀，并向其中加入700μL重悬buffer，再次离心，并用移液枪去除杂质及上清液，保留下层液体；S6、向步骤S5中的下层液体中加入1～2mL重悬buffer，轻柔吹吸混合均匀，然后离心去掉上清液，最后留180～220μL于离心管内，向其中加入450～550μL的重悬buffer，轻柔吹吸重悬，制得细胞悬液；S7、将步骤S6制得的细胞悬液用细胞筛过滤，并向其中加入450～550μL的重悬buffer，离心，收集沉淀，然后用杀菌液清洗2次，离心，去掉上清液，向沉淀中加入预冷的1
×
PBS，并检测其浓度，即得。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1、S2所述的裂解液包括摩尔质量为250mM的蔗糖，摩尔质量为50mM的Tris
‑
HCl，摩尔质量为50...
【专利技术属性】
技术研发人员：周煌凯，高川，陈飞钦，夏昊强，徐毓璇，梁国霞，
申请(专利权)人：广州基迪奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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