从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法技术

本发明专利技术公开了从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法，涉及基因检测技术领域。该方法包括：离心粪便稀释液样本，得到第一上清液；粪便稀释液中的粪便取自于需要进行结直肠癌或结直肠癌前病变检测的主体；离心时，单个离心管中的粪便稀释液样本的体积不高于2mL。该提取方法操作简单，粪便用量少，不需要使用大型的离心设备即可提取，提取效果好，所提取的DNA样本用于后续甲基化检测时具有较好的灵敏度和特异性。检测时具有较好的灵敏度和特异性。检测时具有较好的灵敏度和特异性。

【技术实现步骤摘要】
从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求申请日为2019年12月19日，申请号为201911314364.6，专利技术名称为“从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法”的中国专利技术专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。


[0003]本专利技术涉及基因检测
，具体而言，涉及从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法。

技术介绍

[0004]结直肠癌是我国乃至世界范围内最常见的恶性肿瘤，我国每年新增发病人数约40万，其发病率居所有恶性肿瘤的第三位。早期结直肠癌患者手术5年生存率可高达90％以上，中、晚期患者5年生存率仅10％左右，且大多数结直肠肿瘤生长缓慢、保持沉默或无症状，直到它们达到了一定的大小或发展阶段。因此，结直肠癌是可以通过筛查进行干预的理想靶标。
[0005]肠镜检查是结直肠癌检测和确诊的金标准，但因其需要复杂的肠道准备过程、具有一定的侵入性且需要专业的技术人员，因此在一般人群中的普及率很低。无创检测方法如粪便潜血检查(FOBT)和粪便免疫化学检查(FIT)的灵敏度不高，尤其是在检测I期结直肠癌和进展期腺瘤方面灵敏性较低。甲基化是一种表观遗传修饰，其异常变化可引起DNA构象及DNA与蛋白质相互作用方式等发生改变，从而控制基因表达。DNA甲基化在基因表达调控、细胞增殖分化、发育和基因印记等方面起着重要作用，与肿瘤的发生与发展有密切关系。粪便中含有一定量的肠道脱落细胞，因此可通过检测这些脱落细胞中的某些DNA靶标继而对肠道的健康状况进行评估。越来越多的研究指出，粪便DNA甲基化检测在结直肠癌无创筛查方面显示出很大的优势，其灵敏性和特异性均优于血液甲基化检测和粪便潜血检测。2014年，FDA批准了第一款结直肠癌粪便DNA检测试剂盒Cologuard，该试剂盒可以同时检测粪便中的血红素、KRAS基因突变及另外两个基因的甲基化，其对结直肠癌的检测灵敏性和特异性分别为92％和87％。
[0006]良好的粪便DNA检测效果依赖于上游的粪便处理技术，包括粪便保存技术和粪便DNA提取技术等。例如，用于保存粪便DNA的试剂应尽可能保持粪便中人类基因组的稳定性，同时不受其他基因组的干扰，粪便DNA提取时应尽可能地获取到为数不多的目标DNA。现有的粪便DNA提取技术种类繁多，按照提取基因组的范围来分，可分为提取全部DNA的方法和靶向富集提取特定DNA的方法；按照提取试剂的种类，可分为机械法、磁珠法和化学法等。应当指出的是，不同的提取方法适用于不同的应用场景，产生的检测效果也不同。
[0007]粪便基质成分非常复杂，其中含有种类众多的细菌基因组DNA、植物来源DNA和动物来源DNA，肠道或其他消化道位置的脱落细胞含量相对较少，肠道脱落细胞DNA只占从粪
便中回收到的总DNA的0.1％到0.01％，而人类DNA本身是高度异源的，肠道肿瘤细胞又只占肠道脱落细胞的1％，对于癌症早期的人体，还不到1％。不仅如此，粪便中还含有多聚糖、胆盐、腐殖质、胆酸等PCR抑制物，此时如果采用从粪便中提取全部基因组的做法(如现有技术CN201611113440)，庞大的基因背景和PCR抑制物将非常不利于肿瘤脱落细胞DNA的检测；现有技术CN201710332851使用探针富集人类基因组，虽然在一定程度上特异性地区分了人类基因组和其他基因组，但是仍未实现对人类特定基因的富集，且某些肿瘤来源的DNA片段化较严重，不能通过对人类基因组的整体富集实现对特定肿瘤基因的富集；另外，现有技术中还存在使用粪便量较多、要用到有机溶剂等问题，如CN201811636712，虽然使用较大的粪便量可能会增加目的基因的提取量，但这也不可避免地增加了步骤的繁琐性和成本：需要使用到特定的试剂耗材(如5mL、15mL和50mL离心管)和设备(大型离心机等)。这增加了复杂度，严重降低检测通量、增加检测时间和成本，对于产品的使用推广造成致命限制。然而，在同样的实验条件下减少粪便样本量势必会降低目标DNA的量，增加检测难度，因此现有技术在检测工艺和检测效果之间做取舍：即选择较大粪便稀释液样本体积提取，以保证检测效果。
[0008]综上，目前尚缺少能有效对靶基因进行富集、操作简单、对结直肠癌及其他消化道肿瘤检测灵敏性和特异性优异的粪便DNA提取方法。
[0009]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于提供从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法。该提取方法操作简单，不需要使用大型的离心设备即可提取，提取成本低；所提取的DNA样本用于后续检测中具有较好的灵敏度和特异性，提取效果好。
[0011]本专利技术是这样实现的：
[0012]第一方面，本专利技术实施例提供一种从粪便中提取DNA样本的方法，所述DNA样本适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测，其包括：
[0013]预处理步骤：离心粪便稀释液样本，得到第一上清液；所述粪便稀释液中的粪便取自于需要进行结直肠癌或结直肠癌前病变检测的主体；
[0014]离心时，单个离心管中的粪便稀释液样本的体积不高于2mL，优选为0.5
‑
1.8mL，进一步优选为1.8mL；
[0015]所述样本稀释液包含100
‑
500mmol/L EDTA、50
‑
300mmol/L Tris
·
HCl和50
‑
200mmol/L NaCl；所述粪便稀释液样本由粪便和粪便保存液按照质量体积比为1:(3
‑
5)的比例(1g粪便对应使用3
‑
5ml粪便保存液)混合而成，优选为1:3。
[0016]现有技术的粪便DNA提取过程，通常都使用5mL、15mL或25mL规格的离心管稀释样本进行离心预处理，进而需要使用大型的离心设备。因此具有以下弊端：(1)针对大体积类型样本，大型的离心设备离心力较低，单次离心时间长；(2)离心过程中需要配平，如果不能较好地配平，还容易出现机器故障；(3)使用大型离心设备时每次离心管数较少，离心通量低；(4)预处理过程通常需要多次离心，操作复杂，人力成本及设备成本高。而本专利技术提供的方法在提取过程中，控制粪便稀释液样本体积不高于2mL，进而可以选用2mL和1.5mL规格的离心管进行离心，进而避免了使用大型的离心设备，有利于加快提取过程，提高提取过程的
便捷性，虽然相较于现有的提取方法粪便使用量减少，但同样可取得很好的提取效果，所提取的DNA样本可用于后续甲基化检测中，通过检测结果可以反应主体结直肠癌患病情况或结直肠癌前病变情况，具有较好的灵敏度和特异性。
[0017]在可选的实施方式中，离心的参数设置如下：
[0018]转速10000
‑
13000rpm、时间10s
‑
5min。
[0019]在可选的实施方式中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从粪便中提取DNA样本的方法，所述DNA样本适用于结直肠癌或结直肠癌前病变相关基因的甲基化检测，其特征在于，其包括：预处理步骤：离心粪便稀释液样本，得到第一上清液；所述粪便稀释液样本中的粪便取自于需要结直肠癌检测的主体；离心时，单个离心管中的粪便稀释液样本的体积不高于2mL，优选为0.5
‑
1.8mL，进一步优选为1.8mL。2.根据权利要求1所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，离心的参数设置如下：转速10000
‑
13000rpm，时间10s
‑
5min。3.根据权利要求1所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述方法还包括：吸附步骤：将吸附剂与所述第一上清液混匀以去除所述上清液中的杂质，得到第一混合液，对所述第一混合液离心，得到第二上清液；优选地，所述吸附剂选自交联聚乙烯吡咯烷酮；优选地，所述交联聚乙烯吡咯烷酮为交联聚乙烯吡咯烷酮粉末或交联聚乙烯吡咯烷酮片剂。4.根据权利要求3所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述吸附剂与所述第一上清液的质量体积比为1:(2
‑
4)，优选为1:4。5.根据权利要求4所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述方法还包括：核酸变性步骤：对第二上清液进行变性处理以使DNA双链结构形成单链结构；优选地，所述变性处理的温度85
‑
95℃，时间为5
‑
15min，进一步优选为10min。6.根据权利要求5所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述方法还包括：捕获步骤：往所述第二上清液中加入捕获剂，得到第二混合液；其中，所述捕获剂含有偶联有探针的磁珠，所述探针与待提取基因序列的某一段互补。7.根据权利要求6所述的从粪便中提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：张良禄，吴志诚，董兰兰，甘甜，陈玉珠，李婷婷，
申请(专利权)人：武汉艾米森生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：