System.ArgumentOutOfRangeException: 索引和长度必须引用该字符串内的位置。 参数名: length 在 System.String.Substring(Int32 startIndex, Int32 length) 在 zhuanliShow.Bind() 一种融合转座酶建库的DAP-seq实验方法技术_技高网

一种融合转座酶建库的DAP-seq实验方法技术

技术编号:41313604 阅读:4 留言:0更新日期:2024-05-13 14:56
本申请公开了一种融合转座酶建库的DAP‑seq实验方法,利用Tn5转座酶结合未被转录因子(TF)结合保护的DNA片段区域,产生酶切效应,并完成建库,配合对应的生物信息分析方法,锁定转录因子结合位点(TFBS)和结合基序(motif)。本申请所述的融合转座酶建库的DAP‑seq实验方法是利用转录因子结合位点未被转录因子结合保护的特性,采用Tn5转座酶酶切未被转录因子结合保护的DNA片段区域并完成建库,配合对应的生物信息分析方法,实现了TFBS的精确定位和直接锁定高可信的motif序列。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白沉淀富集,具体涉及一种融合转座酶建库的dap-seq实验方法。


技术介绍

1、转录因子(transcription factor,tf)是基因表达调控研究的热点。全面鉴定基因组中的转录因子结合位点(transcription factor binding sites,tfbs),并总结tf结合基序(motif)的特征,对于解析tf的功能至关重要。染色质免疫沉淀测序(chip-seq)是发现tfbs的有力方法。chip-seq实验依赖于高质量的抗体。稀有或低表达的蛋白质难以制备抗体,非模式生物更是缺乏可用的商业化抗体。因此,chip-seq只适合在模式生物的常见tf中大规模开展。

2、dna亲和纯化测序(dna affinity purification sequencing,dap-seq)则是一种可以大规模开展且部分替代chip-seq的技术。dap-seq通过在体外将基因组dna片段与改造后的tf蛋白结合,完成tf结合的dna片段富集测序,从而实现tfbs的检测。dap-seq不受抗体和物种限制,且具有高通量的优势,该技术自问世以来,已被广泛应用于转录调控和表观组学的研究。

3、但dap-seq在实际应用中,对tfbs和motif的锁定方面依然面临困难。dap-seq方法通常用于非模式生物,目标tf的motif特征和模式生物可能不完全相同。用于dap-seq富集的dna片段长度通常达到300bp~500bp,而tfbs实际长度通常仅为10bp。因此,dap-seq只能通过生物信息的方式进行peak分析。peak的宽度通常也为300bp~500bp,只能提供目标tftfbs大概范围,但无法精确定位tfbs。过于宽泛的peak范围,导致基于peak区域的motif富集分析充满噪音。基于peak的motif富集分析结果通常充满噪音,只能提供一系列候选的tf motif的列表,而无法直接锁定高可信的motif序列。

4、因此,需要对常规的dap-seq实验方法进一步改良,解决tfbs检测精度不足,无法直接确定转录组因子motif的问题。


技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足,本申请的目的在于提供一种融合转座酶建库的dap-seq实验方法,解决tfbs检测精度不足、无法直接确定转录组因子motif的问题。

2、为解决上述问题,本申请所采用的技术方案如下:

3、本申请实施例提供一种融合转座酶建库的dap-seq实验方法,利用tn5转座酶结合未被转录因子结合保护的dna片段区域,产生酶切效应,并完成建库,配合对应的生物信息方法,锁定转录因子结合位点和结合基序。

4、作为进一步优选的方案,本申请实施例所述的融合转座酶建库的dap-seq实验方法包括:

5、转录因子蛋白表达与富集:采用小麦胚芽反应体系进行蛋白表达,表达完成后用含有halo-tag抗体的磁珠溶液进行蛋白富集,获得带halo-tag标签的转录因子蛋白;

6、dna片段化以及片段筛选:将dan样本打断后用含有halo-tag抗体的磁珠溶液筛选dna片段;

7、蛋白亲和吸附dna片段:上述筛选出dna片段中加入上述转录因子蛋白吸附dan片段,获得转录因子结合的dna;

8、tn5转座酶处理tf结合的dna:采用tn5转座酶对上述转录因子结合的dna进行处理,tn5转座酶与未被转录因子结合保护的dna片段区域结合;

9、构建dna文库:采用pcr反应体系,通过pcr扩增,构建dna文库;

10、测序以及生物信息分析:通过软件对tn5转座酶处理后的产物进行测序和生物信息分析,筛选出转录因子结合基序。

11、作为进一步优选的方案,本申请实施例所述的转录因子蛋白表达与富集包括以下步骤:

12、1)采用小麦胚芽反应体系,进行金属浴;

13、2)待麦胚蛋白表达系统反应完成后室温放置,向其中加入平衡缓冲液,得到混合液ⅰ;同时将添加了带halo-tag标签的磁珠的平衡缓冲液的ep管放置到磁力架上处理后弃上清,加入混合液ⅰ,室温震荡混匀并孵育;

14、3)待孵育后,室温放置磁力架上,吸取上清润洗管壁使黏附的磁珠全部洗脱沉底,弃上清;立即加入平衡缓冲液,混匀仪振荡后取出放置磁力架上静置,弃上清;

15、4)重复上述1)-3)的步骤,得到带halo-tag标签的转录因子蛋白。

16、作为进一步优选的方案,本申请实施例所述的转录因子蛋白表达与富集过时,还包括在麦胚蛋白表达系统反应过程中制备带有halo-tag抗体的磁珠:按照每个蛋白样品需要10μl磁珠的量,根据样品个数取出相应体积的磁珠,在ep管中用平衡缓冲液在磁力架上洗涤,最后加pbs溶液均分装在相应个数ep管中。

17、作为进一步优选的方案,本申请实施例所述的dna片段化以及片段筛选包括以下步骤:

18、1)将dna样本打断,将打断后的dna转移到ep管中,加入含有磁珠的平衡缓冲溶液,混匀,室温放置;

19、2)待溶液澄清时,将上清液转移到新的ep管中,此过程原离心管不离开磁力架;

20、3)向上清液中加入含有磁珠的平衡缓冲溶液,吸打混匀,室温放置在磁力架上;

21、4)待溶液澄清时,弃去上清,即加入加入溶剂洗涤后,放置分层后弃掉溶剂;将残余的液体吸干,室温放置;

22、5)待磁珠干燥后,加入无核酸酶水,将ep管从磁力架上取下,吸打混匀,室温溶解;

23、6)溶解后将ep管置于磁力架上静置,分层后将上清移至新ep管中;

24、7)量子比特定量,测回收dna浓度,获得片段化dna;

25、作为进一步优选的方案,本申请实施例所述的所述dna片段化以及片段筛选时,dan的打断是使用仪器bioruptor plus进行操作,打断条件为:温度4℃,on 30s/off 30s为一个循环,打断的dna片段长度为200bp-600bp。

26、作为进一步优选的方案,本申请实施例所述的获得蛋白亲和吸附dna片段包括以下步骤:

27、1)取平衡缓冲溶液到干ep管里,再向其中加入上述片段化dna,吸打混匀成混合液ⅱ;

28、2)弃掉磁力架上磁珠中的平衡缓冲溶液,向其中加入上述带halo-tag标签的转录因子蛋白,混匀仪上震荡孵育;

29、3)待孵育后,室温放置磁力架上,吸取上清润洗管壁使磁珠全部沉底,弃上清,立即加入平衡缓冲液,混匀仪上振荡,取出放置磁力架上,弃上清;

30、4)重复上述1)-3)的步骤,得到转录因子结合的dna。

31、作为进一步优选的方案,本申请实施例中,基于tn5转座酶处理tf结合的dna包括以下步骤

32、1)将上述蛋白亲和吸附的dna片段中的残余溶液吸干净,直接加tn5转座酶反应液,进行孵育;

3本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种融合转座酶建库的DAP-seq实验方法,其特征在于,利用Tn5转座酶结合未被转录因子结合保护的DNA片段区域,产生酶切效应,并完成建库,配合对应的生物信息分析方法,锁定转录因子结合位点和结合基序。

2.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法,其特征在于,包括:

3.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法,其特征在于,转录因子蛋白表达与富集包括以下步骤:

4.根据权利要求3所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法,其特征在于,所述转录因子蛋白表达与富集过时,还包括在麦胚蛋白表达系统反应过程中制备带有halo-tag抗体的磁珠:按照每个蛋白样品需要10μL磁珠的量,根据样品个数取出相应体积的磁珠,在EP管中用平衡缓冲液在磁力架上洗涤,最后加PBS溶液均分装在相应个数EP管中。

5.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法,其特征在于,DNA片段化以及片段筛选包括以下步骤:

6.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法,其特征在于,所述DNA片段化以及片段筛选时,DAN的打断是使用仪器Bioruptor Plus进行操作,打断条件为:温度4℃,on 30s/off 30s为一个循环,打断的DNA片段长度为200bp-600bp。

7.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法,其特征在于,蛋白亲和吸附DNA片段包括以下步骤:

8.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法,其特征在于,基于Tn5转座酶处理TF结合的DNA包括以下步骤:

9.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法,其特征在于,构建DNA文库包括以下步骤:

10.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法,其特征在于,测序以及生物信息分析包括:

...

【技术特征摘要】

1.一种融合转座酶建库的dap-seq实验方法,其特征在于,利用tn5转座酶结合未被转录因子结合保护的dna片段区域,产生酶切效应,并完成建库,配合对应的生物信息分析方法,锁定转录因子结合位点和结合基序。

2.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的dap-seq实验方法,其特征在于,包括:

3.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的dap-seq实验方法,其特征在于,转录因子蛋白表达与富集包括以下步骤:

4.根据权利要求3所述的融合转座酶建库的dap-seq实验方法,其特征在于,所述转录因子蛋白表达与富集过时,还包括在麦胚蛋白表达系统反应过程中制备带有halo-tag抗体的磁珠:按照每个蛋白样品需要10μl磁珠的量,根据样品个数取出相应体积的磁珠,在ep管中用平衡缓冲液在磁力架上洗涤,最后加pbs溶液均分装在相应个数ep管中。

5.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的dap-seq实验方法...

【专利技术属性】
技术研发人员:周煌凯王建晖高川徐毓璇孙鹏鹏
申请(专利权)人:广州基迪奥生物科技有限公司
类型:发明
国别省市:

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