【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白沉淀富集，具体涉及一种融合转座酶建库的dap-seq实验方法。
技术介绍
1、转录因子(transcription factor,tf)是基因表达调控研究的热点。全面鉴定基因组中的转录因子结合位点(transcription factor binding sites,tfbs)，并总结tf结合基序(motif)的特征，对于解析tf的功能至关重要。染色质免疫沉淀测序(chip-seq)是发现tfbs的有力方法。chip-seq实验依赖于高质量的抗体。稀有或低表达的蛋白质难以制备抗体，非模式生物更是缺乏可用的商业化抗体。因此，chip-seq只适合在模式生物的常见tf中大规模开展。
2、dna亲和纯化测序(dna affinity purification sequencing,dap-seq)则是一种可以大规模开展且部分替代chip-seq的技术。dap-seq通过在体外将基因组dna片段与改造后的tf蛋白结合，完成tf结合的dna片段富集测序，从而实现tfbs的检测。dap-seq不受抗体和物种限制，且具有高通量的优势，该技术自问世以来，已被广泛应用于转录调控和表观组学的研究。
3、但dap-seq在实际应用中，对tfbs和motif的锁定方面依然面临困难。dap-seq方法通常用于非模式生物，目标tf的motif特征和模式生物可能不完全相同。用于dap-seq富集的dna片段长度通常达到300bp～500bp，而tfbs实际长度通常仅为10bp。因此，dap-seq只能通过生物信息的方
4、因此，需要对常规的dap-seq实验方法进一步改良，解决tfbs检测精度不足，无法直接确定转录组因子motif的问题。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本申请的目的在于提供一种融合转座酶建库的dap-seq实验方法，解决tfbs检测精度不足、无法直接确定转录组因子motif的问题。
2、为解决上述问题，本申请所采用的技术方案如下：
3、本申请实施例提供一种融合转座酶建库的dap-seq实验方法，利用tn5转座酶结合未被转录因子结合保护的dna片段区域，产生酶切效应，并完成建库，配合对应的生物信息方法，锁定转录因子结合位点和结合基序。
4、作为进一步优选的方案，本申请实施例所述的融合转座酶建库的dap-seq实验方法包括：
5、转录因子蛋白表达与富集：采用小麦胚芽反应体系进行蛋白表达，表达完成后用含有halo-tag抗体的磁珠溶液进行蛋白富集，获得带halo-tag标签的转录因子蛋白；
6、dna片段化以及片段筛选：将dan样本打断后用含有halo-tag抗体的磁珠溶液筛选dna片段；
7、蛋白亲和吸附dna片段：上述筛选出dna片段中加入上述转录因子蛋白吸附dan片段，获得转录因子结合的dna；
8、tn5转座酶处理tf结合的dna：采用tn5转座酶对上述转录因子结合的dna进行处理，tn5转座酶与未被转录因子结合保护的dna片段区域结合；
9、构建dna文库：采用pcr反应体系，通过pcr扩增，构建dna文库；
10、测序以及生物信息分析：通过软件对tn5转座酶处理后的产物进行测序和生物信息分析，筛选出转录因子结合基序。
11、作为进一步优选的方案，本申请实施例所述的转录因子蛋白表达与富集包括以下步骤：
12、1)采用小麦胚芽反应体系，进行金属浴；
13、2)待麦胚蛋白表达系统反应完成后室温放置，向其中加入平衡缓冲液，得到混合液ⅰ；同时将添加了带halo-tag标签的磁珠的平衡缓冲液的ep管放置到磁力架上处理后弃上清，加入混合液ⅰ，室温震荡混匀并孵育；
14、3)待孵育后，室温放置磁力架上，吸取上清润洗管壁使黏附的磁珠全部洗脱沉底，弃上清；立即加入平衡缓冲液，混匀仪振荡后取出放置磁力架上静置，弃上清；
15、4)重复上述1)-3)的步骤，得到带halo-tag标签的转录因子蛋白。
16、作为进一步优选的方案，本申请实施例所述的转录因子蛋白表达与富集过时，还包括在麦胚蛋白表达系统反应过程中制备带有halo-tag抗体的磁珠：按照每个蛋白样品需要10μl磁珠的量，根据样品个数取出相应体积的磁珠，在ep管中用平衡缓冲液在磁力架上洗涤，最后加pbs溶液均分装在相应个数ep管中。
17、作为进一步优选的方案，本申请实施例所述的dna片段化以及片段筛选包括以下步骤：
18、1)将dna样本打断，将打断后的dna转移到ep管中，加入含有磁珠的平衡缓冲溶液，混匀，室温放置；
19、2)待溶液澄清时，将上清液转移到新的ep管中，此过程原离心管不离开磁力架；
20、3)向上清液中加入含有磁珠的平衡缓冲溶液，吸打混匀，室温放置在磁力架上；
21、4)待溶液澄清时，弃去上清，即加入加入溶剂洗涤后，放置分层后弃掉溶剂；将残余的液体吸干，室温放置；
22、5)待磁珠干燥后，加入无核酸酶水，将ep管从磁力架上取下，吸打混匀，室温溶解；
23、6)溶解后将ep管置于磁力架上静置，分层后将上清移至新ep管中；
24、7)量子比特定量，测回收dna浓度，获得片段化dna；
25、作为进一步优选的方案，本申请实施例所述的所述dna片段化以及片段筛选时，dan的打断是使用仪器bioruptor plus进行操作，打断条件为：温度4℃，on 30s/off 30s为一个循环，打断的dna片段长度为200bp-600bp。
26、作为进一步优选的方案，本申请实施例所述的获得蛋白亲和吸附dna片段包括以下步骤：
27、1)取平衡缓冲溶液到干ep管里，再向其中加入上述片段化dna，吸打混匀成混合液ⅱ；
28、2)弃掉磁力架上磁珠中的平衡缓冲溶液，向其中加入上述带halo-tag标签的转录因子蛋白，混匀仪上震荡孵育；
29、3)待孵育后，室温放置磁力架上，吸取上清润洗管壁使磁珠全部沉底，弃上清，立即加入平衡缓冲液，混匀仪上振荡，取出放置磁力架上，弃上清；
30、4)重复上述1)-3)的步骤，得到转录因子结合的dna。
31、作为进一步优选的方案，本申请实施例中，基于tn5转座酶处理tf结合的dna包括以下步骤
32、1)将上述蛋白亲和吸附的dna片段中的残余溶液吸干净，直接加tn5转座酶反应液，进行孵育；
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【技术保护点】
1.一种融合转座酶建库的DAP-seq实验方法，其特征在于，利用Tn5转座酶结合未被转录因子结合保护的DNA片段区域，产生酶切效应，并完成建库，配合对应的生物信息分析方法，锁定转录因子结合位点和结合基序。
2.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法，其特征在于，包括：
3.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法，其特征在于，转录因子蛋白表达与富集包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法，其特征在于，所述转录因子蛋白表达与富集过时，还包括在麦胚蛋白表达系统反应过程中制备带有halo-tag抗体的磁珠：按照每个蛋白样品需要10μL磁珠的量，根据样品个数取出相应体积的磁珠，在EP管中用平衡缓冲液在磁力架上洗涤，最后加PBS溶液均分装在相应个数EP管中。
5.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法，其特征在于，DNA片段化以及片段筛选包括以下步骤：
6.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法，其特征在于，所述DN
7.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法，其特征在于，蛋白亲和吸附DNA片段包括以下步骤：
8.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法，其特征在于，基于Tn5转座酶处理TF结合的DNA包括以下步骤：
9.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法，其特征在于，构建DNA文库包括以下步骤：
10.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的DAP-seq实验方法，其特征在于，测序以及生物信息分析包括：
...【技术特征摘要】
1.一种融合转座酶建库的dap-seq实验方法，其特征在于，利用tn5转座酶结合未被转录因子结合保护的dna片段区域，产生酶切效应，并完成建库，配合对应的生物信息分析方法，锁定转录因子结合位点和结合基序。
2.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的dap-seq实验方法，其特征在于，包括：
3.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的dap-seq实验方法，其特征在于，转录因子蛋白表达与富集包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的融合转座酶建库的dap-seq实验方法，其特征在于，所述转录因子蛋白表达与富集过时，还包括在麦胚蛋白表达系统反应过程中制备带有halo-tag抗体的磁珠：按照每个蛋白样品需要10μl磁珠的量，根据样品个数取出相应体积的磁珠，在ep管中用平衡缓冲液在磁力架上洗涤，最后加pbs溶液均分装在相应个数ep管中。
5.根据权利要求1所述的融合转座酶建库的dap-seq实验方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：周煌凯，王建晖，高川，徐毓璇，孙鹏鹏，
申请(专利权)人：广州基迪奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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