一种动物单细胞悬液的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于细胞培养技术领域，具体涉及一种动物单细胞悬液的制备方法及其应用。本发明专利技术提供的制备方法，主要包括取样、酶解、重悬洗涤、活性计数等过程，采用本发明专利技术所述的制备方法可以制备出活性高达95％的单细胞悬液，且能够应用在多个物种不同组织单细胞悬液制备，可满足各类高通量单细胞测序平台的细胞悬液质量要求，具有很高的应用价值。具有很高的应用价值。具有很高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种动物单细胞悬液的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种动物单细胞悬液的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]目前新一代高通量单细胞测序平台(例如，以10
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genomics平台为代表)以高通量、低价格和单分子分辨率和高稳定性，能从不同大分子层面来研究单个细胞，成为单细胞研究的重要技术研究方式，可广泛应用于肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等重要领域。由于高通量单细胞测序仪器一般要求细胞在液相中实现流动分选，所以要求投入的样本必须为细胞悬液。然而在实际研究过程中，往往因细胞悬液的细胞总量不够、细胞活性不高、细胞成团、细胞碎片等问题达不到上机建库要求，很多研究项目因悬液质量问题而被迫取消，因此，亟待开发一套成熟的方法用于制备合格的单细胞动物悬液。
[0003]目前酶消化法是制备实体组织单细胞悬液最常用的方法，首先需要破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等，其次破坏组织细胞的紧密连接结构的蛋白，再清除组织粘多糖物质。中国专利技术专利CN111621466A公开了一种肺动脉组织单细胞悬液的制备方法，中国专利CN110951683A和CN110747164A均公开了一种牙髓干细胞的制备方法，中国专利CN104357395A公开了从胃癌组织中高效分选单核样骨髓来源免疫抑制细胞的方法，中国专利CN107748130A公开了一种动物心脏单细胞悬液的制备及检测方法，但这些方法都只针对某一类组织，应用场景有限。中国专利技术专利CN111647549A公开了一种动植物中单细胞的分离方法，该方法中使用的硝酸镧含有金属离子镧，会抑制反转录酶的活性，影响后续单细胞转录组测序文库构建的数据质量，而且，硝酸镧属于化学危险品，对人体有害且具有助燃性。
[0004]基于上述缺陷，中国专利技术专利CN111088222A公开了一种脂肪组织的单细胞悬液的制备方法，该方法虽然具有步骤简单，获得的细胞数量多，制得的单细胞悬液可用于10
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Genomics等高通量单细胞测序平台等优点，但是采用该方法制得的细胞活性仍然在90％以下，且该方法涉及到的酶较多，在制备过程中，细胞容易被杂菌污染。
[0005]综上可知，开发一种高通量单细胞测序平台通用的，易于操作的动物单细胞悬液制备方法迫在眉睫。

技术实现思路

[0006]基于现有技术普遍存在的缺陷，本专利技术提供了一种动物单细胞悬液的制备方法及其应用。采用本专利技术所述的制备方法可以制备出活性高达95％的单细胞悬液，且能够应用在多个物种不同组织单细胞悬液制备，具有很高的应用价值。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0008]一种动物单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：
[0009]S1、将目的组织用预冷的5mL、1
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PBS缓冲液洗掉血渍，然后将组织剪成1mm3的小
块，将其置于2mL的离心管中，然后向离心管中加入1mL的酶混合液，制得预混液；
[0010]S2、将步骤S1制得的预混液置于37℃下解离20～50min，然后取10μL解离物置于电子显微镜下观察，至清楚看到细胞且无团块，停止解离，制得解离细胞液；
[0011]S3、将步骤S2制得的解离细胞液转入15mL离心管中，加入3mL预冷的1
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PBS缓冲液，并用细胞筛过滤1～2次，然后离心，去掉上清液，制得细胞沉淀；
[0012]S4、向步骤S3制得的细胞沉淀中加入1mL预冷的1
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PBS缓冲液，重悬细胞，然后加入3mL红细胞裂解液，充分混匀，于室温下静置1～5min，制得细胞裂解物；
[0013]S5、将步骤S4制得的细胞裂解物重悬、离心处理，重复2次，去除上清液，用细胞筛过滤1～2次，用3mL预冷的1
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PBS缓冲液冲洗一次，离心去除上清液，制得细胞沉淀；
[0014]S6、将步骤S5制得的细胞沉淀用天然杀菌剂洗涤2～3次，然后离心，去掉上清液，向沉淀中加入预冷的1
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PBS缓冲液，利用显微镜细胞计数板，台盼蓝染色检测细胞浓度、活性，筛选浓度在800
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1500个/μL，活性＞80％的细胞，置于冰上，即得。
[0015]优选地，步骤S1、S3～S6中所述的预冷的1
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PBS缓冲液为4℃预冷、含质量百分数为0.04％的BSA的缓冲液。
[0016]优选地，步骤S1所述的酶混合液包含1000μL、37℃预热的、含0.04％BSA的1
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HBSS缓冲液，10％胶原蛋白酶，5％中性蛋白酶，2U/mL的DNA酶I，10％的透明质酸酶。
[0017]优选地，步骤S3所述的细胞筛孔径为70μm，所述离心过程为于4℃，1600～1700rpm转速下离心4～6min。
[0018]优选地，步骤S4所述的红细胞裂解液为将8.29g NH4Cl，1g KHCO3，37.2mg EDTA
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2Na混合，加蒸馏水定容至1000mL，调节PH至7.4。
[0019]优选地，步骤S5所述的重悬、离心处理，重复2次的具体操作为：将细胞裂解物置于5mL、1
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PBS下重悬细胞，然后4℃水平离心机，1600～1700rpm离心4～6min；吸走上清液，向沉淀中再次加入5mL预冷的1
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PBS，重悬细胞，4℃水平离心机，1600～1700rpm离心4～6min，去掉上清液。
[0020]优选地，步骤S5所述的细胞筛孔径为40μm，所述离心过程为于4℃，1600～1700rpm转速下离心4～6min。
[0021]优选地，步骤S6所述的天然杀菌剂由质量百分数为10％的山梨酸溶液与质量百分数为15％的酒石酸溶液按体积比7～10：1～4组成；所述离心过程为于4℃，1600～1700rpm转速下离心4～6min。
[0022]本专利技术还提供了一种利用所述的制备方法在构建单细胞测序文库中的应用。
[0023]优选地，将制备的细胞置于冰上，于30min内建库。
[0024]本专利技术，首次提供了一种用于动物单细胞悬液的制备方法，而本专利技术，在制备过程中，添加了一种混合酶，通过调整各种酶的添加量，根据组织类型看细胞消化效果进行调整，可以实现不同物种、多个部位单细胞悬液的制备，同时又使其可以满足高通量单细胞测序平台的特殊细胞悬液质量需求。
[0025]在此基础上，专利技术人还采用自制的天然杀菌剂对细胞沉淀进行处理，消除在制备过程中可能滋生的细菌，降低了细菌杀死细胞的风险，进一步保证了本专利技术方法制备的单细胞悬液的活性。使得细胞活性维持在95％以上。
[0026]此外，需要注意的是，本专利技术的提供的制备方法适用于动物细胞尤其是哺乳动物
细胞，如果制备单细胞悬液的组织不是哺乳动物，则不需要进行步骤S4的裂解及后续静置过程。
[0027]与现有技术，本专利技术提供的单细胞悬液的制备方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种动物单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将目的组织用预冷的5mL、1
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PBS缓冲液洗掉血渍，然后将组织剪成1mm3的小块，将其置于2mL的离心管中，然后向离心管中加入1mL的酶混合液，制得预混液；S2、将步骤S1制得的预混液置于37℃下解离20～50min，然后取10μL解离物置于电子显微镜下观察，至清楚看到细胞且无团块，停止解离，制得解离细胞液；S3、将步骤S2制得的解离细胞液转入15mL离心管中，加入3mL预冷的1
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PBS缓冲液，并用细胞筛过滤1～2次，然后离心，去掉上清液，制得细胞沉淀；S4、向步骤S3制得的细胞沉淀中加入1mL预冷的1
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PBS缓冲液，用移液枪吹打混匀，重悬细胞，然后加入3mL红细胞裂解液，充分混匀，于室温下静置1～5min，制得细胞裂解物；S5、将步骤S4制得的细胞裂解物重悬、离心处理，重复2次，去除上清液，用细胞筛过滤1～2次，用3mL预冷的1
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PBS缓冲液冲洗一次，离心去除上清液，制得细胞沉淀；S6、将步骤S5制得的细胞沉淀用天然杀菌剂洗涤2～3次，然后离心，去掉上清液，向沉淀中加入预冷的1
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PBS缓冲液，利用显微镜细胞计数板，台盼蓝染色检测细胞浓度、活性，筛选浓度在800
‑
1500个/μL，活性＞80％的细胞，置于冰上，即得。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1、S3～S6中所述的预冷的1
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PBS缓冲液为4℃预冷、含质量百分数为0.04％的BSA的缓冲液。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述的酶混合液包含1000μL、3...

【专利技术属性】
技术研发人员：周煌凯，高川，陈飞钦，夏昊强，徐毓璇，梁国霞，
申请(专利权)人：广州基迪奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：