人类卵泡卵丘细胞或/和颗粒细胞的细胞系及其制备方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种人类卵泡卵丘细胞或/和壁颗粒细胞的细胞系及其制备方法，包括：将人类卵泡卵丘细胞或/和壁颗粒细胞分别进行第一离心获得第一固体；将梯度离心培养液加入到第一固体中，第二离心后分成三层，取所述三层的中间层加入磷酸盐缓冲液第三离心获得第三固体，后加入透明质酸酶溶液、裂解缓冲液，第四离心获得第四固体加入磷酸盐缓冲液第五离心获得纯化细胞，加入培养液中传代培养获得人类卵泡卵丘细胞或/和壁颗粒细胞的细胞系；培养液按体积份数计包括：α

【技术实现步骤摘要】
人类卵泡卵丘细胞或/和颗粒细胞的细胞系及其制备方法


[0001]本专利技术实施例涉及细胞内分泌
，特别涉及一种人类卵泡卵丘细胞或/和颗粒细胞的细胞系及其制备方法。

技术介绍

[0002]卵泡颗粒细胞(Granulosa Cells,GCs)是卵泡内的体细胞，在卵泡的生长发育过程中起着至关重要的作用。随着卵泡的发育至窦卵泡期，颗粒细胞分化为在空间和功能上不同的两个种群：围绕在卵母细胞周围的卵丘细胞(Cumulus Cells,CCs)和排列在卵泡壁上的壁颗粒细胞(Mural Granulosa Cells，MGCs)。一般认为，卵丘细胞与壁颗粒细胞是起源一致、位置不同的的同一种细胞。
[0003]然而，研究表明卵丘细胞和壁颗粒细胞不仅仅在卵泡内的位置上有所不同，而且在功能和基因表达等方面也具有差异。在卵巢中，颗粒细胞是为卵母细胞生长提供物理支持和微环境的原发细胞类型，当卵母细胞进入生长发育的后期，卵泡形成窦腔。从次级卵泡的发育直至形成卵泡窦腔阶段，颗粒细胞开始分化为避颗粒细胞和卵丘细胞。卵丘细胞围绕在卵母细胞周围，与卵母细胞直接接触形成卵丘
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卵母细胞
‑
复合体,其数量与卵母细胞密切相关。人类卵母细胞周围的卵丘细胞数一直被认为是卵子质量和着床潜能的有用标志。而壁颗粒细胞则分布在卵泡壁上，与卵泡壁相关，主要承担类固醇，雌激素的生成功能。卵丘细胞的分化由卵母细胞分泌有效的生长因子(Oocytes secrete effective growth factors,OSFs)介导，而壁颗粒细胞的形成则受卵泡外、垂体前叶分泌的FSH调控。卵丘细胞是卵母细胞的支持细胞，在卵母细胞生长发育、成熟、排卵和受精的过程中起着重要作用。放射冠被认为是卵母细胞周围的第一层卵丘细胞，卵丘细胞在靠近卵母细胞的内层比外层更加紧凑，呈向心性膨胀。卵丘细胞直接接触卵母细胞，胞质突起穿越透明带，与卵母细胞建立缝隙连接，形成卵丘
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卵母细胞
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复合物，该复合物直接影响基因表达和蛋白合成，从而实现卵丘细胞和卵母细胞间的沟通，导致卵母细胞的分化、扩张和成熟，缝隙连接由细胞膜间通道蛋白聚合体构成，连接蛋白C
×
43和C
×
37是与之最密切相关的两个蛋白，该通道允许离子、小分子和小代谢物通过但不允许蛋白质、核酸等大分子通过。缝隙连接帮助卵丘细胞为卵母细胞生长发育提供能量和营养，至发育晚期，缝隙连接通过调节通道的减少或关闭促进卵母细胞成熟。壁颗粒细胞排列在卵泡内壁上，与卵泡生长、分化、成熟以及后续的排卵和维持妊娠密切相关，主要执行内分泌功能，是女性雌激素的主要来源。壁颗粒细胞还通过分泌蛋白酶促进排卵，排卵后壁颗粒细胞会逐渐转化为产生孕酮的黄体细胞，参与随后的一系列激素调节过程。在促黄体生成素的作用下，壁颗粒细胞和卵泡膜内层细胞分裂增生，细胞成多边形，胞质内有黄色颗粒和脂滴，呈黄色称为黄体。颗粒黄体细胞由卵泡颗粒细胞转变成，位于黄体中央，细胞大，染色淡，主要分泌孕酮。
[0004]综上可知，卵泡卵丘细胞和颗粒细胞可产生一些天然雌激素和抗细胞老化以及衰老因子，若能体外培养获得卵泡卵丘细胞或/和颗粒细胞的细胞系将会为生产天然雌激素和抗细胞老化以及衰老因子提供有效的保障。然而，迄今为止，尚没有建立人类卵泡卵丘细
胞和壁颗粒细胞的细胞系的相关报道。人类卵泡卵丘细胞和壁颗粒细胞在体外培养十分困难：1)卵丘细胞和颗粒细胞在体外培养生长缓慢；2)卵丘细胞和颗粒细胞在体外培养过程中很容易失去其原有特征标记基因的表达很难维持其原有特性。
[0005]因此，如何成功开发一种人类卵泡卵丘细胞或/和颗粒细胞的细胞系及其制备方法，成为亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术实施例目的是提供一种人类卵泡卵丘细胞或/和壁颗粒细胞的细胞系及其制备方法，不仅可以使得体外培养生产加快，而且不会失去特征标记基因，同时特征标记基因的表达能够维持其原有特性，成功获得人类卵泡卵丘细胞或/和颗粒细胞的细胞系。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术实施例提供了一种人类卵泡卵丘细胞或/和壁颗粒细胞的细胞系的制备方法，所述方法包括：
[0008]将人类卵泡卵丘细胞或/和壁颗粒细胞分别进行第一离心以固液分离，获得第一固体；
[0009]将浓度为75
‑
85％梯度离心培养液和浓度为35
‑
45％梯度离心培养液依次加入到所述第一固体中，第二离心后分成三层，取所述三层的中间层，获得第二固体；
[0010]将所述第二固体加入磷酸盐缓冲液进行第三离心以固液分离，获得第三固体；
[0011]将所述第三固体加入透明质酸酶溶液进行消化，后加入裂解缓冲液裂解，再进行第四离心以固液分离，获得第四固体；
[0012]将所述第四固体加入磷酸盐缓冲液进行第五离心以固液分离，获得纯化细胞；
[0013]将所述纯化细胞加入培养液中进行传代培养，获得人类卵泡卵丘细胞或/和壁颗粒细胞的细胞系；其中所述培养液按体积份数计包括：α
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MEM或者DMEM 100份；胎牛血清5
‑
15份；青链霉素混合液0.5
‑
1.5份；促卵泡生长激素0.012
‑
0.02份。
[0014]进一步地，所述第二离心的转速为280
‑
320g，所述第二离心的时间为13
‑
17min。
[0015]进一步地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为(10
±
1)mM。
[0016]进一步地，所述第一离心、所述第三离心、所述第四离心和所述第五离心均包括：转速为280
‑
320g，时间为8
‑
12min。
[0017]进一步地，所述消化的时间为3
‑
5min。
[0018]进一步地，所述裂解的温度为2
‑
6℃，所述裂解的时间为8
‑
12min。
[0019]进一步地，所述将所述纯化细胞经过滤后加入培养液中进行传代培养，包括：
[0020]将所述纯化细胞经过滤后获得待接种细胞；
[0021]将所述待接种细胞接种到培养液中培养直至汇合度≥90％，后进行细胞传代培养。
[0022]进一步地，所述过滤采用70μm细胞滤网；所述待接种细胞数与所述培养液体积的比值为(0.8
×
106‑
1.2
×
106)个：(9
‑
11)mL。
[0023]进一步地，对于所述卵泡卵丘细胞，所述传代培养的代数≥15代；对于所述壁颗粒细胞，所述传代培养的代数≥25代。
[0024]本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0025]本专利技术实施例提供的一种人类卵泡卵丘细胞或/和壁颗粒细胞的细胞系的制备方
法，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人类卵泡卵丘细胞或/和壁颗粒细胞的细胞系的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将人类卵泡卵丘细胞或/和所述壁颗粒细胞分别进行第一离心以固液分离，获得第一固体；将浓度为75
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85％梯度离心培养液和浓度为35
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45％梯度离心培养液依次加入到所述第一固体中，第二离心后分成三层，取所述三层的中间层，获得第二固体；将所述第二固体加入磷酸盐缓冲液进行第三离心以固液分离，获得第三固体；将所述第三固体加入透明质酸酶溶液进行消化，后加入裂解缓冲液裂解，再进行第四离心以固液分离，获得第四固体；将所述第四固体加入磷酸盐缓冲液进行第五离心以固液分离，获得纯化细胞；将所述纯化细胞加入培养液中进行传代培养，获得人类卵泡卵丘细胞或/和壁颗粒细胞的细胞系；其中所述培养液按体积份数计包括：α
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MEM或者DMEM 100份；胎牛血清5
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15份；青链霉素混合液0.5
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1.5份；促卵泡生长激素0.012
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0.02份。2.根据权利要求1所述的一种人类卵泡卵丘细胞或/和壁颗粒细胞的细胞系的制备方法，其特征在于，所述第二离心的转速为280
‑
320g，所述第二离心的时间为13
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17min。3.根据权利要求1所述的一种人类卵泡卵丘细胞或/和壁颗粒细胞的细胞系的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为(10
±
1)mM。4.根据权利要求1所述的一种人类卵泡卵丘细胞或/和壁颗粒细胞的细胞系的制备方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：千日成，高二梦，
申请(专利权)人：艾尔斯浙江医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：