高保真性限制性内切核酸酶制造技术

提供用于工程化改造具有降低的星号活性的突变酶的方法和组合物，其中，所述突变酶在特定缓冲液中的保真性指数(FI)大于非突变酶在相同缓冲液中的FI。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高保真性限制性内切核酸酶
技术介绍
限制性内切核酸酶是以序列特异性方式切割双链DNA的酶(Roberts，R.J. Proc Natl Acad Sci USA 102:5905-5908 (2005) ；Roberts,et al. Nucleic AcidsRes31:1805-1812 (2003) ；Roberts, et al. Nucleic Acids Res 33:D230-232 (2005)；Alves, et al. restriction endonucleases (限制件内切核酸酶),“Protein Engineeringof Restriction Enzymes (限制酶的蛋白质工程)，，，ed. Pingoud, Springer-Verlag BerlinHeidelberg, New York, 393-407 (2004))。它们广泛存在于原核生物体中(Raleigh, etal. , Bacterial Genomes Physical Structure and Analysis (细菌基因组物理结构和分析),Ch. 8, eds. De Bruijin, et al. , Chapman & Hall, New York, 78-92 (1998)),其中它们形成限制-修饰系统的部分，该限制-修饰系统主要由内切核酸酶和甲基转移酶组成。相关的甲基转移酶甲基化其配对内切核酸酶识别的相同特定序列，并使修饰的DNA抵抗内切核酸酶的切割，以便适当保护宿主DNA。然而，当有外源DNA，尤其是噬菌体DNA侵入吋， 外源DNA将在其被完全甲基化之前降解。限制性修饰系统的主要生物学功能是保护宿主免于噬菌体感染(Arber Science 205:361-365(1979))。也提出了其它功能，如涉及重组和转座(Carlson, et al. Mol Microbiol, 27:671-676 (1998) ；Heitman, Genet Eng (NY) 15:57-108(1993) ；McKane, et al. Genetics 139:35-43(1995))。大约3，000种已知限制性内切核酸酶对其250种以上的不同靶序列的特异性可以被认为是它们最令人感兴趣的特征。在发现了第一种限制性内切核酸酶的序列特异性性质(Danna, et al. , Proc Natl Acad Sci USA 68:2913-2917(1971) ；Kelly, et al. , J MolBiol 51:393-409(1970))之后，不久科学家们就发现，某些限制性内切核酸酶在非最佳条件下切割与其限定的识别序列相似但不一致的序列(Polisky, et al.，Proc Natl AcadSci USA, 72:3310-3314(1975) ；Nasri, et al. , Nucleic Acids Res 14:811-821(1986))。这种松弛的特异性(relaxed specificity)被称为限制性内切核酸酶的星号活性(staractivity;。星号活性是分子生物学反应中的问题。星号活性在克隆载体或其它DNA中引入不期望的切割。在诸如其中某些DNA底物需要被限制性内切核酸酶切割以产生独特指纹的法医应用的情况中，星号活性将改变切割图式特性，从而使分析复杂化。避免星号活性在诸如链置换扩增(Walker, et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 89:392-396 (1992))和基因表达系列分析(Velculescu, et al. , Science 270:484-487 (1995))的应用中也是至关重要的。
技术实现思路
在本专利技术的实施方式中，提供了确定限制性内切核酸酶及其变体的保真性指数(FI)的方法，其包括选择反应缓冲液和含有限制性内切核酸酶的结合和切割位点的DNA底物；允许连续稀释的限制性内切核酸酶或其变体切割DNA底物；和測定限制性内切核酸酶和一种或多种其变体的每ー种的FI。在实施方式中，该方法还包括比较限制性内切核酸酶及其变体的FI，以获得变体的改进因子，例如大于2。在本专利技术的实施方式中，选择缓冲液，其包含醋酸钾、三羟甲基氨基甲烷醋酸盐和醋酸镁；或氯化镁。另外的实施方式包括(a)组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQ ID No. I的酶，其中，一个或多个突变的位置选自S36、K77、P154、E163、Y165和K185。(b)组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQ ID No. 2的酶，其中，一个或多个突变的位置选自K198和Q148。(C)组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQ ID No. 3的 酶，其中，一个或多个突变的位置选自S15、H20、E34、M58、Q95、R106、K108、T181、R187和R199。(d)组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQ ID No. 4的酶，其中，一个或多个突变的位置选自D16、D148和E132。(e)组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQ ID No. 5的酶，其中，一个或多个突变的位置选自K75、N146和D256。(f)组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQ ID No. 6的酶，其中，一个或多个突变的位置选自E198和D200。(g)组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQ ID No. 7的酶，其中，一个或多个突变的位置选自K229、E025、R034和Q261。(h)组合物，其包括包含其中突变位置是K225的SEQ ID No. 8的酶。(i)组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQ ID No. 9的酶，其中，一个或多个突变的位置选自H137、D177、K363、K408、R411、Q215、Q226和Q230。(j)组合物，其包括包含其中突变位置是F376的SEQ ID No. 10的酶。(k)组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQ ID No. 11的酶，其中，一个或多个突变的位置选自R78、T140、E152、R199和F217。(I)组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQ ID No. 12的酶，其中，一个或多个突变的位置选自 G26、P105、T195、Q210、Y147、Y193、K114、T197、S245、D252 和 Y027。(m)组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQ ID No. 13的酶，其中，一个或多个突变的位置选自H10、N208、K48、K74、R75、Y56、K58和M117。(η)组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQ ID No. 14的酶，其中，一个或多个突变的位置选自Κ014、Q069、Ε099、R105、R117、G135和Υ035。(ο)组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQ ID No. 15的酶，其中一个或多个突变的位置选自Ν106、Q169、Ε314和R126。(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.02.05 US 61/301,666;2010.09.29 US 61/387,8001.确定限制性内切核酸酶及其变体的保真性指数(FI)的方法，包括 选择反应缓冲液和含有所述限制性内切核酸酶的结合和切割位点的DNA底物； 允许连续稀释的限制性内切核酸酶或其变体切割所述DNA底物；和 測定所述限制性内切核酸酶及ー种或多种其变体中每ー个的FI。2.权利要求I所述的方法，还包括比较所述限制性内切核酸酶及所述其变体的FI，以获得所述变体的改进因子。3.权利要求2所述的方法，其中，所述改进因子大于2。4.权利要求I所述的方法，其中，所述反应缓冲液包含醋酸钾、三羟甲基氨基甲烷醋酸盐和醋酸镁；或氯化镁。5.组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQID No. I的酶，其中，一个或多个突变的位置选自S36、K77、P154、E163、Y165和K185。6.权利要求5所述的组合物，其中，所述突变的酶在预定缓冲液中的FI大于在所述预定缓冲液中没有所述突变的酶。7.组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQID No. 2的酶，其中，一个或多个突变的位置选自K198和Q148。8.权利要求7所述的组合物，其中，所述突变的酶在预定缓冲液中的FI大于在所述预定缓冲液中没有所述突变的酶。9.组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQID No. 3的酶，其中，一个或多个突变的位置选自 S15、H20、E34、M58、Q95、R106、K108、T181、R187 和 R199。10.权利要求9所述的组合物，其中，所述突变的酶在预定缓冲液中的FI大于在所述预定缓冲液中没有所述突变的酶。11.组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQID No. 4的酶，其中，一个或多个突变的位置选自D16、D148和E132。12.权利要求11所述的组合物，其中，所述突变的酶在预定缓冲液中的FI大于在所述预定缓冲液中没有所述突变的酶。13.组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQID No. 5的酶，其中，一个或多个突变的位置选自K75、N146和D256。14.权利要求13所述的组合物，其中，所述突变的酶在预定缓冲液中的FI大于在所述预定缓冲液中没有所述突变的酶。15.组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQID No. 6的酶，其中，一个或多个突变的位置选自E198和D200。16.权利要求15所述的组合物，其中，所述突变的酶在预定缓冲液中的FI大于在所述预定缓冲液中没有所述突变的酶。17.组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQID No. 7的酶，其中，一个或多个突变的位置选自K229、E025、R034和Q261。18.权利要求17所述的组合物，其中，所述突变的酶在预定缓冲液中的FI大于在所述预定缓冲液中没有所述突变的酶。19.组合物，其包括包含其中突变位置是K225的SEQID No. 8的酶。20.权利要求19所述的组合物，其中，所述突变的酶在预定缓冲液中的FI大于在所述预定缓冲液中没有所述突变的酶。21.组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQID No. 9的酶，其中，一个或多个突变的位置选自 H137、D177、K363、K408、R411、Q215、Q226 和 Q230。22.权利要求21所述的组合物，其中，所述突变的酶在预定缓冲液中的FI大于在所述预定缓冲液中没有所述突变的酶。23.组合物，其包括包含其中突变位置是F376的SEQID No. 10的酶。24.权利要求23所述的组合物，其中，所述突变的酶在预定缓冲液中的FI大于在所述预定缓冲液中没有所述突变的酶。25.组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQID No. 11的酶，其中，一个或多个突变的位置选自R78、T140、E152、R199和F217。26.权利要求25所述的组合物，其中，所述突变的酶在预定缓冲液中的FI大于在所述预定缓冲液中没有所述突变的酶。27.组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQID No. 12的酶，其中，一个或多个突变的位置选自 G26、P105、T195、Q210、Y147、Y193、K114、T197、S245、D252和 Y027。28.权利要求27所述的组合物，其中，所述突变的酶在预定缓冲液中的FI大于在所述预定缓冲液中没有所述突变的酶。29.组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQID No. 13的酶，其中，一个或多个突变的位置选自H10、N208、K48、K74、R75、Y56、K58和Μ117。30.权利要求29所述的组合物，其中，所述突变的酶在预定缓冲液中的FI大于在所述预定缓冲液中没有所述突变的酶。31.组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQID No. 14的酶，其中，一个或多个突变的位置选自Κ014、Q069、Ε099、R105、R117、G135和Υ035。32.权利要求31所述的组合物，其中，所述突变的酶在预定缓冲液中的FI大于在所述预定缓冲液中没有所述突变的酶。33.组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQID No. 15的酶，其中，一个或多个突变的位置选自N106、Q169、E314和R126。34.权利要求33所述的组合物，其中，所述突变的酶在预定缓冲液中的FI大于在所述预定缓冲液中没有所述突变的酶。35.组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQID No. 16的酶，其中，一个或多个突变的位置选自 T20、P52、Y67、K68、R75、E86、Q90、S91、Q93、H121 和 G172。36.权利要求35所述的组合物，其中，所述突变的酶在预定缓冲液中的FI大于在所述预定缓冲液中没有所述突变的酶。37.组合物，其包括包含其中一个或多个氨基酸已经被突变的SEQID No. 17的酶，其中，一个或多个突变的...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱振宇，A·昆比，管胜昔，孙大鹏，黄益澍，赖煦卉，陈少康，李向晖，徐双勇，张春花，
申请(专利权)人：新英格兰生物实验室公司，
类型：
国别省市：